新月弯孢霉生物转化RS及其与兰色犁头霉生物转化RSA   的比较研究

  杨顺楷   成都  610041

项目简介：利用本实验室搜藏筛选出的新月弯孢霉（Curvularia lunata）AS 3.4381和兰色犁头霉（Absidia coerulea）AS 3.65两菌株单菌和/或组合条件下较系统比较考察了生物转化化合物S（RS）和醋酸化合物S（RSA）制氢化可的松（HC）的实验研究，形成了下述4条可供选择的工艺路线：

[1] 新月弯孢霉 静息菌丝体连续两批次生物催化RS生产氢化可的松；

[2]b-环糊精包合技术在微生物转化生产HC中的应用；

[3]双菌多轮序列协同转化甾体RSA制氢化可的松；

[4]有机溶剂促溶体系添加底物生物转化RSA制氢化可的松。

试验结果表明：工艺[1]在2L和10L发酵罐的克量级制备试验在RS投料浓度两批次为2x0.2%（w/v），通过Ⅱ级发酵收获生长培养好的菌丝，置于RS丙酮微粒结晶的磷酸缓冲液（pH 6.0，0.05mol/L）同体积液体转化混合物进行搅拌通气培养（1∶1，v/v），TLC/HPLC监测转化过程，当目标产物氢化可的松达到最高积累浓度（80%，w/v）时中止转化，适时转入第二轮；对两批液体转化反应混合物液固分离的上清液和经磷酸缓冲液混和菌丝通气搅拌回收菌丝吸附甾体的上清液合并，进行甾体产物提取分离及精制，在可比操作条件下，转化RS获得了HC（克量级试验）收率57.9 %（SD=3.30，n=7）的较稳定可重现的结果;

工艺[2]应用b-环糊精包合技术，甾体RS底物浓度3g/L的磷酸缓冲液介质一次性批式2L发酵罐转化，HC克量制备收率为57.8%；与此相对照实验比较AS 3.65在2L罐转化RSA产出HC收率仅44.7%（以45%计），前者（经化学水解为RS）与后者比较以RSA计，前者收率高出后者5-7%；这就表明该新月弯孢霉AS 3.4381新工艺用于替代我国传统的HC工业生产菌蓝色犁头霉AS 3.65的霉菌氧化是可行的，14a-羟化副产物（产率小于20%）可考虑作为开发制备两种乳腺癌甾体药物中间体用；

工艺[3]应用各自生长培养好的AS 3.65和AS 3.4381菌株的活性菌丝所组成的协同序列转化体系中，AS 3.65首先将RSA酶法水解为RS，继后加入AS 3.4381菌株的活性菌丝，整合两者优势的C11b-羟基化转化能力，在首轮添加RSA质量浓度为1.3g/L和1g/L的磷酸缓冲液转化介质体系中，所选定的协同序列转化体系可分别被重复有效利用3轮和6轮，实现RS转化为HC的高转化率达82%和85%；加之，本工艺明显降低了高底物浓度RSA对C11-羟基化的影响，并有效抑制了AS 3.4381和AS 3.65单独转化过程中出现的14a-OH-RS和11a-OH-RS副产物。可见，本双菌多轮序列协同转化甾体RSA（菌丝酶法水解为RS）制氢化可的松较好地整合了AS 3.65较强的水解活力及AS 3.4381较高的C11b-羟基化能力；多轮批式菌丝生物催化活力的保持在于菌丝细胞吸附甾体RS所致在“饥饿培养”下C11b-羟基化酶的重新诱导合成，较好地实现RSA——>RS——>HC的酶法去乙酰化和继之的C11b-羟基引入。

工艺[4] 建立起一套有机溶剂促溶体系添加底物RSA进行双菌序列协同生物转化制氢化可的松，RSA质量浓度从首轮的3g/L起始，连续重复利用双菌游离菌丝3次，催化总RSA量达5.5g/L,实现RSA——>RS——>HC的双菌工业生物催化工艺过程；且在重复3批次的克量摇瓶实验制备HC获得转化工艺稳定重现性好的结果，HC收得率达到平均52%，较国内现行业内HC收得率45-47%高出5-7%，这表明本工艺有工业规模开发价值。此外，国内外鲜见报道，发现新月弯孢霉（Curvularia lunata）AS 3.4381对底物RSA呈现出较好的去乙酰化和继之的C11b-羟基引入生成HC的生物转化能力。

综上所述，本实验室团队近年开展的霉菌氧化甾体C11b-羟基化研究，针对我国业内氢化可的松生产霉菌氧化长期存在的问题，结合国内外的研究进展，较系统地开展了两菌生物转化新工艺比较实验研究。经过总结，提出了上述4条工艺路线，可供业内人士及企业研发中心参考评估，列项进行逐级工艺放大的工业规模开发。我们认为技术成熟度好，具备了向相关企业进行技术转移的基本条件，可真正实现科研院所实验室成果有效地向企业转移。这对提高我国重要薯蓣皂素资源利用率，经由半合成工艺生产氢化可的松（100t/a）的行业技术进步具有重要意义。

参考文献

1        Yang SK(杨顺楷)，Yi KX（易奎星），Yang YL（杨亚力）.Progress of study on C11b-hydroxylation of steroid by microbial transformation. Chinese J. Bioprocess Eng.(生物加工过程)，2006，4（2）：7-14

2       Yi KX（易奎星），Yang YL（杨亚力）, Yang SK（杨顺楷）et al, Bioconversion of Compound S into hydrocortisone using a novel process of twi-run sequence bioconversion by the by the mycelium of Curvularia lunata AS 3.4381. Chinese J. Bioprocess Eng.( 生物加工过程)，2005,3(4):40-44

3       Yi KX（易奎星），Yang YL（杨亚力）, Yang SK（杨顺楷）et al. Application of  b-cyclodextrin inclution technique in the biotransformation of hydrocortisone. Chinese J. Pharmaceuticals(中国医药工业杂志),2006,37(5):311-314

4       Yang SK（杨顺楷），Xiao Y(肖勇)，Lai T（赖涛）.微生物甾体转化生产氢化可的松加工过程研究的新进展[EB/OL]. 中国科技网通讯，成都，中国科学院成都生物研究所，2003：6

5       Fan LP（范林萍），Yang SK（杨顺楷），Wu ZL（吴中柳）et al. A novel process of multi-run sequence bioconversion of RSA for production hydrocortisone with Absidia coerulea AS 3.65 and Curvularia lunata AS 3.4381. Chinese J. Bioprocess Eng.(生物加工过程)，2009，7（6）：15-20

6       Fan LP（范林萍），Yang SK（杨顺楷），Wu ZL（吴中柳）et al. Bioconversion of RSA to HC with Free mycelia cooperative system of A. coerulea- C.lunata: Developing a novel mode of substrate addition with co-solvents. Chinese J. Bioprocess Eng.(生物加工过程)，2010，8(6):15-21