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氢气可治疗新生儿脑缺血缺氧

已有 16013 次阅读 2008-11-11 08:56 |个人分类:氢气生理盐水|系统分类:科研笔记| 论文, 氢气, 氢分子医学

该文首次采用注射含氢水的方法治疗脑损伤，是对去年日本Nature Med文章的改进和提高。原来的研究是采用呼吸一定浓度的氢气,达到治疗脑缺血再灌注损伤的目的，但是，通过呼吸的方法不仅在给药过程中存在爆炸的危险，而且需要比较特殊的设备，操作比较复杂，在临床上难以推广，因此，寻找更加实用的给药方法也是需要探讨的问题。经过理论推算，如果将纯氢气在生理盐水中溶解，经过一定的处理，使其达到饱和溶解，可制造出氢气的生理盐水饱和溶液，这样就可通过注射方法给药。

本文实现了这一目的.
中文摘要:
含氢气生理盐水对大鼠新生儿脑缺血的神经保护作用

脑缺血缺氧是新生儿脑损伤的重要因素。本研究目的是利用大鼠新生儿脑缺血模型，观察含氢气生理盐水对脑缺血后脑损伤的长期和短期保护作用。采用7天生大鼠，左恻颈总动脉结扎， 8%低氧37 ?C处理90分钟，制备动物模型。分别在模型制备后即刻和8小时后腹腔注射5 ml/kg饱和氢气生理盐水。24小时后断头处死动物进行TTC、尼氏和TUNEL染色。利用caspase-3活性、MDA和Iba-1免疫组化染色评价细胞死亡、炎症和氧化损伤程度。利用自发活动实验、水迷宫检测5周后神经功能情况。结果发现，氢气生理盐水对能有效降低caspase-3活性、MDA, Iba-1水平、梗死体积，提高长期神经行为功能。氢气生理盐水可能具有治疗新生儿脑缺血等各类脑缺血性疾病的价值。

本文首次证明通过注射含氢盐水可以治疗缺血损伤, 从日本首先发表呼吸2%氢治疗脑缺血的文章以后, 很多研究相继发表,证明呼吸氢可以治疗肝缺血、心肌缺血和小肠移植损伤，通过引用含氢水可以治疗人类糖尿病后氧化损伤，可以治疗应激动导致的脑损伤，可以治疗基因模型动物的脑损伤和动脉硬化。这些研究表明，给一定浓度的氢是一种非常好的治疗氧化损伤的手段。但是，通过注射的方法在临床上将是更理想的给药手段。我们经过反复研究，制备出含氢液体，并用这种注射液治疗脑损伤，效果理想。我们将在其他不同模型中继续证明这种注射液的作用，并深入研究其作用机制。我们相信，本文章的发表将会有力推动氢生物学效应的研究。希望有兴趣的战友加入我们的团队。
我们将来将希望在，缺血、炎症、创伤和各类慢性损伤模型中进行该课题研究，请继续关注我们的工作，我们相信，这些研究将给人类健康带来一个新的希望。氢的系列药物将属于高效、低毒、广谱的治疗药物。
如果将来确实能实现临床应用,本文将具有十分重要的意义.

Neuroprotective Effects of Hydrogen Saline in Neonatal Hypoxia-ischemia Rat Model

[/color]Abstract
Cerebral hypoxia–ischemia (HI) represents a major cause of brain damage in
the term newborn. This study aimed to examine the short and long-term
neuroprotective effect of hydrogen saline (H2 saline) using an established
neonatal HI rat pup model. Seven-day-old rat pups were subjected to left
common carotid artery ligation and then 90 min hypoxia (8% oxygen at 37 ?C).
H2 saturated saline was administered by peritoneal injection (5 ml/kg)
immediately and again at 8 h after HI insult. At 24 h after HI, the pups were
decapitated and brain morphological injury was assessed by
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC), Nissl, and TUNEL staining. Acute
cell death, inflammation and oxidative stress were evaluated at 24 h by
studying caspase-3 activity, MDA measurement as well as Iba-1
immunochemistry in the brain. At 5 weeks after HI, spontaneous activity test
and Morris water maze test were conducted. We observed that H2 saline
treatment reduced the caspase activity, MDA, Iba-1 levels, the infarct ratio, and
improved the long-term neurological and neurobehavioral functions. H2
saline has potentials in the clinical treatment of HI and other ischemia-related

cerebral diseases.[color=red]

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文章在DXY上被好心人翻译成中文

1 引言
新生儿脑损伤最重要的原因是脑缺血缺氧，虽然其机制不是很清楚，但是神经元细胞死亡或调亡可能在其中扮演重要的作用.值得一提的是在受到损伤的最初几天内脑中半暗带发生的凋亡是可以作为治疗的靶点的，可是现在还没有治疗脑缺血缺氧病人的特异性手段。
在缺血性脑损伤包括新生儿缺血缺氧事件中炎症和氧化应激是凋亡的主要原因，有报道小神经胶质细胞参与了脑缺血缺氧诱导的炎症过程。小胶质细胞中的同种异体移植炎性因子-1是其活性升高的一个指标。缺血缺氧后的氧化应激导致DNA、细胞膜和蛋白的损伤，最终导致细胞凋亡，丙二醛是脂质胞膜氧化后的产物也是氧化损伤的标志。
有报道氢气在心、脑和肝缺血再灌注损伤后有保护作用，氢气可以中和自由基减少氧化应激，可是临床应用氢气还要考虑其安全性和方便性，本研究中，我们给予新生缺血缺氧的动物模型腹膜内注射饱和的氢气盐溶液，考察其神经保护作用。

2 结果
2.1 尼氏染色法我们用尼染检测了氢气盐溶液的三个剂量组来找到其中的有效剂量，图1显示的是缺血缺氧24小时后的小狗脑皮层和海马的尼染结果图，发现在皮层和海马的CA1区域有大量的深色致密的神经元，而且H2W组的阳性细胞要多于模型组，我们用5ml/kg剂量组用于以下的研究，因为它的效果要好于其它剂量组。

2.2 TTC染色图2显示了出生8天的大鼠在缺血缺氧24小时后的TTC染色结果图，发现模型组梗死区比例(10.8%)明显高于H2W组(0.99%)，后者与正常对照组相当。

2.3 丙二醛含量检测缺血缺氧24小时后的丙二醛含量，发现模型组明显高于对照组，而给予氢气盐溶液后可以降低缺血缺氧造成的MDA含量升高。

2.4 TUNEL染色图3是不同组的TUNEL染色放大效果图，从放大的图看，海马和皮层的细胞核可见被染色，结果显示模型组有明显增加的阳性染色，而给予氢气盐溶液后可明显可降低核染，在正常小狗的组织样本内也能见到一些核染的细胞。

2.5 细胞凋亡蛋白酶-3的活性测定图5显示了caspase-3活性测定结果，模型组皮层caspase-3的活性为1.18±0.23，而海马为0.93±0.22。在给予氢气盐溶液后可见其活性的明显下降，结果分别为0.12±0.09和0.09±0.10，这与TUNEL染色结果相同。

2.6免疫组化分析图4显示Iba1阳性细胞有小的核、固缩的胞质和细的分支突起，这种细胞在白质和灰质等实质中都有发现，它们的特征外形和广泛分布与经典的分支小胶质细胞都高度一致。氢气盐水处理可明显减低缺血缺氧24小时后的样品阳性细胞的数目。

2.7 体重不同组别在处理15天后没有体重上的差异，在20天后却发现模型组和给药组体重上的差异，而对照组和给药组没有区别。

2.8 功能测试本位反射实验印证了模型组大鼠的感觉运动功能受到影响，0分代表正常功能而1分和2分代表感觉运动功能的缺失。所有的对照组得分为0，而22.22%的模型组得分为0，77.78% 为 1，66.67%为2；63.64%给药组得分为0，36.36% 得分为1，9.09%为2。卡方检验组之间有显著的差异。

2.9 自主活动测试为了显示行为学上的时间依赖性，图6显示了自发运动的轨迹和统计结果。结果提示所有的组大鼠在测试箱中随着时间的增加活动呈减少态势。可是给药组比模型组更活跃，移动次数也增多，而且与正常组无区别，给药组平均总距离也比模型组少。

2.10 Morris水迷宫测定缺血缺氧24小时后大鼠的避水潜伏期，发现到达平台的时间对照组为12±1.23秒，而模型组为27±3.21秒，给予氢气盐水后时间大大缩短(15±1.89秒)，而且给药组与对照组无区别，提示氢气盐水提高了缺血缺氧造成的认知与学习能力的下降趋势。

3 讨论
我们考察了新生大鼠腹膜给予饱和氢气盐溶液的神经保护作用，短期作用提示了其明显减少梗死面积，增加活的神经元数目，减少凋亡细胞数量，抑制caspase-3活性，阻止小胶质细胞激活，减少氧化应激水平，这些短期的作用在缺血缺氧5周后可以转为神经保护的长期作用，提示了氢气盐溶液治疗新生儿脑功能障碍的一个潜在治疗手段。

氢气的神经保护作用是中和自由基，尤其是羟基自由基和过亚硝酸盐。羟自由基是氢氧离子的中性形式，同时也是细胞代谢的正常产物，它呈高还原性，在体内很短的半衰期（9-10秒）使其成为非常危险的基团。除此之外，细胞急剧氧化中产生了超氧负离子和一氧化氮，它们可以引起炎症反应，在正常情况下，它们一起反应并产生大量的活性氧分子—过氧亚硝酸盐阴离子是潜在的氧化试剂，可引起DNA片段化与脂质氧化，同时它在体液中与二氧化碳反应形成反应中间体，后者可氧化巯基和硝酸酚类化合物，如酪氨酸。

在新生儿缺血缺氧脑损伤后，活性氧与活性氮，如•OH, O2-, hydrogen dioxide (H2O2), NO, ONOO–在细胞死亡中扮演重要的作用，这其中•OH 和 ONOO–更是强的还原性并不加区分地与核酸、脂质和蛋白反应。脑有潜在的防御体系，包括饮食中的自由基清除基（维生素C和维生素E），内源性谷胱甘肽和抗活性氧自由基酶。可是，还没有发现针对•OH 和 ONOO–的解毒系统。近来，Ohsawa等发现了氢气分子可选择性减少自由细胞体系中的•OH and ONOO–，因此在大鼠的中脑动脉闭塞模型中产生抗氧化活性的治疗作用。氢气的这一能力可能是本实验中其神经保护作用的机制。

近来研究报告显示氢气作为抗氧剂可以在脑与肝脏的缺血性损伤中通过选择性清除•OH and ONOO–发挥保护作用，最近一篇文献也提示了吸入氢气减少了心肌缺血再灌注损伤的大鼠模型中的梗死区面积，给予腹膜注射氢气盐溶液可以防止应激造成的身体活动受限从而导致学习记忆下降。虽然2%氢气的含量在临床上是安全的，可是实施起来并不方便，因为这需要房间或者面罩，因此，用氢气盐溶液迅速注射就不用考虑安全性的问题了。

我们选择性研究了脑损伤的两个机制：炎症和氧化应激。小胶质细胞激活可以引起炎症反应，因为在中枢神经系统内存在免疫细胞，它们对中枢性损伤如新生儿缺血缺氧起到正常的免疫应答作用并通过吞噬作用去除受损细胞。Iba1是一个147个氨基酸的钙结合蛋白，被普遍看作小胶质细胞的标志，其基因和蛋白都与AIF-1类似，后者参与各种炎症反应，如有报道其在神经性炎症紊乱和脑缺血损伤引起的小胶质细胞激活中起重要作用，其表达上调见于神经元细胞凋亡和中枢运动性神经元和感觉的受损退化。本研究中，氢气盐溶液减少脑损伤可能是通过抑制缺血缺氧造成的炎症性反应，除此之外，它也能通过减少AIF-1的表达而降低凋亡的发生，我们在另一组实验中利用氢气也得到相似的结果。氧化应激可能导致炎症的发生或者提高炎症反应，氢气盐溶液通过减轻新生儿脑中缺血缺氧造成的氧化应激就可以减少炎症和凋亡的发生。

即使氢气盐溶液和氢气本身的药代动力学有什么不同还不清楚并值得进一步研究，盐溶液优于氢气的特点就是安全性、给药的方便性和更高的溶解度，已证实高于4%的氢气浓度可导致炎症与危险，应用氢气还需要密封的房间或者面罩，以前的研究有用氢气水溶液灌胃给药的。即使口服给药是安全的但是水中的氢气容易蒸发并在胃中和小肠中损失，就很难控制浓度和吸收了，因此，我们利用腹膜注射给药就能达到迅速抽取药液迅速注射，从而避免氢气逸到周围了，氢气盐溶液的另一个比氢气和水溶液优势的就是可以达到更高的给药浓度和准确度

本研究的特点就是评价了神经生物学和行为学上的长期作用，我们发现氢气盐溶液不仅能阻止或者减少早期的病理性改变诸如梗死，或者生化改变诸如炎症和氧化应激，也能产生长期的功能恢复作用。该结果提示了其在新生儿缺血缺氧或其他脑损伤临床上的应用前景。总之，腹膜给予氢气盐溶液可以通过减轻炎症和氧化应激减少新生儿缺血缺氧所造成的脑损伤，从而减少细胞凋亡的发生，提高长期的神经生物学和行为学功能。