一、原理【1】
考马斯亮兰G250在一定浓度的乙醇和酸性条件下,可配成淡红的溶液。当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物。反应化合物在465-595nm处有最大光吸收值。化合物深浅与蛋白浓度的高低成正比例关系。故可以检测595nm的光吸收值来计算蛋白含量。
二、Bradford显色液的制备【1】
1)bradford储存液:100ml 95%乙醇,200ml 88%磷酸,350mg 考马斯亮兰G250,室温下长期稳定
2)bradford工作液:425ml 双蒸水,15ml 95%乙醇,30ml 88%磷酸,30ml bradford储存液;waterman 1#滤纸过滤,保存于室温棕色瓶内。使用前需再过滤。
三、实验材料
BSA(1mg/mL), 待测蛋白,待测蛋白所用缓冲液,96孔板,酶标仪
四、BSA标准样品的配制
样品编号 BSA(ul) Buffer(ul)
1 0 30
2 5 25
3 10 20
4 15 15
5 20 10
6 25 5
7 30 0
五、待测样品的准备
待测样品预先用OD
280粗测浓度,大致确认浓度后,进行稀释和BSA样品2号、7号在bradford显色液中显色的深浅进行目测比较,确定比较合适的稀释比例。然后制备不同浓度待测蛋白样品2-3个,每个样品10ul,待用。
六、测定方法
取96孔酶标板,向孔内加入140ul的bradford显色液,再加入蛋白样品3ul,混合均匀。每个BSA及待测蛋白样品需重复2-3个。然后选取酶标仪595nm波长进行扫描读数。
实验结果用EXCEL进行平均,做出BSA的标准曲线,根据线性方程和稀释后待测蛋白样品的读数,计算出待测蛋白的浓度
【1】蛋白质技术手册,汪家政 范明 主编,科学出版社
https://blog.sciencenet.cn/blog-454485-451073.html