粘红酵母CIBAS A 1401的PAL酶分子生物学部分工作

                                            杨顺楷                 四川         成都

经近年对该菌种的分子生物学结合生物信息学手段研究，发现从植物来源的PAL，例如从欧芹、马铃薯、大豆，以及从微生物来源的近缘种红冬孢酵母和胶红酵母中克隆的PAL基因，通过其PAL基因的同源性比较研究发现，PAL基因在它们之间同源性很低，很难找到可用来设计引物的同源性很高的核苷酸片断。我们通过氨基酸同源性比对，选择较保守的区域设计简并引物进行RT-PCR，首先扩增出一段386bp长的序列，但为了便于下一步进行5’RACE实验，又利用首次RT-PCR的结果及其氨基酸同源性比对，又设计了一对引物进行RT-PCR；考虑到扩增片断较长而且GC含量较高，故使用一种特定GC缓冲液体系，扩增出了810bp长的序列。在获得此片断的基础上设计引物，将两次RT-PCR和3’RACE的结果测序后进行拼接，获得长为2188bp的PAL cDNA序列。经相关软件翻译成为对应的氨基酸序列，其长度为714个氨基酸。用DNAMAN软件进行氨基酸序列结构与同源性分析，发现与其发布的红冬孢酵母（Rhodotorula toruloide）PAL相应氨基酸序列相似性为28.1％，和胶红酵母（Rhodotorula mncilaginosa）PAL相应氨基酸序列相似性为29.9％，而与植物来源的欧芹、大豆PAL相应氨基酸序列相似性仅有12.8％和14.7％。由此可见，PAL氨基酸序列在酵母与植物之间相差较大。通过Sanproside程序对该714个氨基酸序列进行分析，发现127～143位的氨基酸序列GTISASGCLSPISYIAA为PAL的特征序列。但与植源的欧芹、大豆PAL相应氨基酸序列进行比对时发现，在植物中该序列为GTITASGDLVPLSYIAG，其第4位、第10位与第17位的氨基酸与红酵母PAL相应位置的氨基酸不同。目前该粘红酵母菌株CIBAS A 1401该核心PAL基因序列已提交到GenBank，获得序列号（Accession Number）为DQ013364；这为进一步克隆PAL全长cDNA及构建苯丙氨酸解氨酶基因工程菌奠定了基础。