微生物单宁酶与植物单宁知识介绍

                                                            杨顺楷               四川     成都

   

        微生物单宁酶是同“植物单宁”一类生物活性有机化合物的“新家族”这一与时俱进的新概念提出密切相关。伴随着植物和微生物生物学的迅猛发展，对植物单宁（同义语：植物多酚，鞣质）这一古老而又现代的复杂天然有机化合物的神秘面纱正在逐步揭开，旧有的知识概念正在柀修订，植物单宁生物化学，分子细胞生物学前沿科技领域不断推出的新研究成果，反过来又给传统的应用领域带来创新机遇，影响最直接的莫过于食品药品保健品等工业生物技术领域。

植物单宁，俗称鞣质，或植物多酚(plant polyphenols),表明该天然产物化学结构的多样性，反应的多重性，分子量在500~3,000之间，或者更高的生物大（中）分子物质。这类化合物已经给公衆键康施加了重大的影响，其生物活性成分主要功能有止血，抗氧化，抗病毒，促进氮代谢，改善肾功能，以及精神病治疗，故称植物单宁为天然有机化合物的新家族。国际上统一将单宁的化学结构分为可水解单宁（hydrolyzable tannins）和缩合单宁(condensed tannins)。前者母核为葡萄糖或多羟基化合物如儿茶素的没食子或并没食子酸酯的多聚物。新近有关可水解单宁生物合成形成和沉积位点在叶肉细胞壁这一主要场所，这已为酶学—免疫组织化学实験证据所证实；这与早期报告的“单宁液泡说”不同。因此，现在可以把单宁液泡内容物看作本质未定的多酚化合物，由于使用非特异性显色反应检测法所致。缩合单宁，如称为原花色素（proanthocyanidins），大多数发现在飼料豆科植物中，但是它的生物合成仍是不确定性的^[6]。可水解单宁物质在水相介质存在酸、碱、以及生物催化剂—单宁酶或加热时易水解为酚酸、糖或多元醇酸。例如，真菌单宁酶（EC.20）可以在温和的生理水相反应介质体系中直接酶水解单宁底物的缩酚键、酯键，积累显著数量的小分子优势产物沒食子酸（GA），以及其它化合物，如五倍子单宁的葡萄糖，塔拉单宁的奎尼酸等。

    单宁酶主要耒源于微生物，属水解酶类（EC.20），主要集中分布在曲霉属（Aspergillus）菌种，另外青霉、酵母、细菌，以及植物和动物，如山羊的胃粘液中也存在活性单宁酶，它具有均能促进单宁的水解。已经报道的产单宁酶微生物菌种有黑曲霉（Asp。niger），它具有工业应用安全性好（GRAS）的特点。

        

本实验室分离选育的黑曲霉（Asp.niger）CIB 13-1337菌株，在使用五倍子单宁诱导搖床培养产生的单宁酶液体培养物，经由硫酸胺分级沉淀，EDTA-Sepharose离子交換层析、Sephadex G-150凝胶过滤，从该菌株的发酵液和菌丝体中分离纯化得到凝胶电泳均一单宁酶条带的分析结果：该酶作用的最适温度为，最适pH值5.5；在温度10~，pH4~6之间保持稳定。金属离子对单宁酶没有明显的激活作用，Fe²⁺和Mn²⁺则对酶有抑制作用。纯化酶样品经SDS-PAGE测分子量为5.8 KD，其等电点为pH4.1。

借助海藻酸钙凝胶包埋法，制成固定化单宁酶酶制剂,批式酶法水解五倍子单宁制GA，连续使用3次制备试験，GA净产率61%；且固定化单宁酶经连续多次使用，转化能力未见明显下降，说明该固定化酶稳定性较好。使用该菌种生长培养好的整菌丝在2L自动控制玻离发酵罐转化制备GA,可连续使用7次，生物催化活力不减；车间放大试験到500L发酵罐规模，批式生物转化五倍子单宁公斤级水平制GA，在分批添加底物总量达8~10%质量浓度（w/v）,可定量转化底物为GA，发酵液GA积累浓度达到55.0~70.0g/L,回收的粗品产物GA经大孔吸附树脂柱层析精制，GA净回收率90%

有关黑曲霉单宁酶的其它结构特征，包括分子中氮含量为12.9%（凯氏定氮法），用二硝基氟苯法测氨基末端，有2个DNP-氨基酸产物，分别为DNP-Ala与DNP-Arg，该结果证实黄曲霉单宁酶为2个亚基组成。另外一个显著特征是该酶蛋白为糖蛋白；且不同来源的单宁酶分子糖含量有差异，例如黑曲霉中提取的单宁酶糖基含量高达43%，酵母单宁酶为62%；选育的黑曲霉单宁酶糖链部分糖基组成为葡萄糖和甘露糖，糖含量12.3%；蛋白质含量为72.5%，肽链通过Ser和Thr与糖基连接，糖基与酶的功能关系尚未見报道。

 

丝状真菌作为重要的工业菌种，近年来已经在30多种真菌中建立起了DNA转化系统，具有很强的蛋白分泌能力，能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等，糖基化方式与高等真核生物相似。对于黑曲霉单宁酶的分子生物学研究国外也已经着手进行，对其基因表达调控方面重组菌产生单宁酶进行了实验研究，证明指导单宁酶生物合成的mRNA极不稳定，放线菌酮可迅速阻止单宁酶的产生。虽然丝状真菌的基因操作相对较新，但近年来该技术进展较快，现已有来自Asp. oryzae和Asp.var. awamori的数十个基因被克隆及测序。国内，黄日波等也首次开展了单宁酶基因在黑曲霉ST31中的克隆与表达，该研究从米曲霉克隆单宁酶基因，构建单宁酶基因穿梭表达载体ANEP2-SP2—tan,然后通过原生质转化法导入黑曲霉ST31中进行表达，结果表明重组菌株的单宁酶活力为104.02U/ml发酵液，比原始出发菌株米曲霉提高2~3倍。

国外，特别是80年代以来，日美德等国家对植物单宁/微生物单宁酶的基础理论和应用研究已取得长足进展，并已经在茶饮业得到实际应用，获得较好的经济效益。国内，近年来作者实験室针对我国特产五倍子单宁生物资源及微生物单宁酶酶法加工生产GA的生物化工新工艺，已有鉴定了的阶段放大实験成果。加之，过去十年开展以黑曲霉为代表的微生物单宁酶SSF制酶曲及采用生物催化与生物加工过程的实験研究工作，已应用于滇橄榄果的果汁澄清，均都已经在攀枝花宇森酒业公司得到初步应用，成效显著。

 

在实验室制备作结构测定用的单宁酶酶制剂时，黑曲霉菌种接种培养在产酶液体培养基中，26~，振荡培养2~2.5日，在未出现黑色孢子前，过滤分离菌丝；收获的白色菌丝体经匀化器破碎、超声波处理，于0~离心分离，除去沉渣；上清液经旋转蒸发，减压浓缩到1/5液量体积，再次低温离心，所得上清液直接置于冻干处理，或用5倍量冷甲醇沉淀，离心，干燥，制得的浅灰色粉末即是单宁酶酶制剂。它可用于没食子单宁作底物的酶水解反应，制得唯一的酚性组份终产物GA。该酶制剂可作为植物化学成份结构鉴定用。

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