(1)原理:DCFH-DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜,从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测 DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
(2)材料与仪器
DCFH-DA购自Sigma公司,分子量487,用DMSO溶解,4.87 mg/ml 配成10 Mm,终浓度稀释成25µM; FLUOstarOPTIMA酶标仪。
(3)步骤
① 接种细胞:96孔板,接种细胞数为每孔1.5万个细胞。
② DCFH-DA孵育:接种24小时后用有糖earle’s 液洗两遍,并换上终浓度为25µM DCFH-DA培养箱孵育30 min.
③ 处理:DCFH-DA孵育结束后,用有糖earle’s 液洗两遍给予处理(氧化应激或药物)。
④ 检测:FLUOstarOPTIMA酶标仪检测荧光,488nm激发波长,525nm发射波长。
(4)注意点
① 要有无DCFH-DA孵育的对照;
② 多次清洗,注意操作规范,不要将细胞洗掉。
③ 如果处理4小时以内,可以先孵育荧光染料,再处理后检测;如果处理超过4小时,建议先处理,再孵育染料检测。
https://blog.sciencenet.cn/blog-390931-346843.html
上一篇:
凋亡和坏死检测(二)下一篇:
JC-1检测线粒体膜电位