技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一种可用于治疗缺血再灌注损伤的含氢注射液。

背景技术

缺血是临床疾病中最常见原因之一，缺血再灌注损伤是脑缺血等最重要病理生理过程，缺血性疾病通常可在早期采用溶栓和抗自由基损伤等技术来防治。氢气目前仅作为保健品使用，尚未应用于临床，如日本和我国有学者用呼吸氢气治疗脑、肝、心缺血再灌注损伤，日本有公司用含有氢气的饮用水作为美容保健品，至今未见有关采用含氢注射液防治缺血再灌注损伤的相关报道。

发明内容

本发明提供一种含氢注射液，用于防治脑缺血等导致的组织损伤和器官功能障碍。其为一种含有浓度为0.2~1.0 mM氢气的注射液。

制备方法如下：

1.脱气处理

生理盐水、糖盐水或碳酸氢钠注射液等医用注射液软包装袋，如含氢生理盐水等，用低压舱0.4~0.8个绝对压大气压减压处理2~24小时，再在常压下放置4~12小时使超饱和部分的气体充分析出，将析出的气体抽除；

2.低温预处理

将脱气处理后的注射液软包装袋置于2~10℃充分冷却，以便注入氢气后增加对氢气的溶解度；

3.注入纯氢气

从低温处理后的注射液软包装抽取总体积5～15%的生理盐水，注入与抽出液体体积相同的该温度下的纯氢气（常压）；

4.加压助溶

将注入氢气后的注射液软包装放入加压舱，1~5℃下持续加压12~24小时，使氢气充分溶入注射液，减压后取出置0~5℃保存备用，稳定24小时后即可使用。按本方法制备的含氢注射液经中国科学院大连化学物理研究所测氢气浓度为1.6-2.0%。

本发明注射液经动物实验，对大鼠脑缺血再灌注损伤模型，能明显减少脑梗死体积、减轻组织损伤、减少神经组织细胞凋亡数量、降低海马和皮层凋亡酶活性，因此可用于治疗脑缺血再灌注损伤。另外在心肌缺血再灌注、肾脏缺血再灌注和肝脏缺血再灌注损伤模型中观察到类似效果。因此本发明含氢注射液可用作治疗缺血再灌注损伤的药物。

附图说明

图1 为大鼠脑缺血再灌注后梗死体积的比较图谱。

图2 为大鼠脑缺血再灌注后尼氏染色图谱。

图3 为大鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡图谱。

图4为大鼠脑缺血再灌注后皮层和海马凋亡酶活性检测图谱。

具体实施方式

现结合附图和实施例对本发明作详细描述。

实施例1. 制备含氢生理盐水注射液

1.脱气处理

生理盐水注射液500 mL，用低压舱0.4个绝对压大气压下减压处理2小时，取出后常压下放置4小时，将析出气体用注射器抽除；

2.低温预处理

将上述脱气处理后的注射液软包装袋置 2℃常压下 2个小时充分冷却；

3.注射纯氢气

从上述低温处理后的软包装抽取50 mL的生理盐水，注入2℃常压下50 mL的纯氢气（上海基量标准气体有限公司氢标准气产品，下同）；

4.加压助溶

将注入氢气后的注射液软包装放入加压舱，5℃下持续加压12小时，使氢气充分溶入注射液，减压后取出置5℃常压下保存24小时后即可使用。

实施例2. 制备含氢葡萄糖盐水注射液

注射液为葡萄糖盐水注射液、加压助溶后置4℃常压保存备用，其余同实施例1。

实施例3. 制备含氢生理盐水注射液

脱气处理时，注射液软包装袋置于低压舱，在绝对压0.5个大气压减压处理14小时，取出后常压下放置5小时；低温预处理时，将脱气处理后的注射液软包装袋置4℃冰箱冷却56小时；加压助溶时，将注入氢气后的注射液软包装袋4℃下持续加压15小时；取出后置4℃常压保存备用，其余同实施例1。

动物实验

实验动物：SD雄性大鼠，体重220~250克，购买自第二军医大学实验动物中心。

取大鼠65只，雄性，随机分成5组：正常对照组、阴性对照组、实施例1制备的注射液低、中、高剂量治疗组，每组13只。除正常对照组外，其余各组大鼠先制备成脑缺血再灌注损伤模型，再灌注后10 min，分别腹腔注射生理盐水和本发明实施例1制备的注射液。其中，本发明注射液低剂量组按体重注射0.3 ml/100g，本发明注射液中剂量组注射0.6 ml/100g，本发明注射液高剂量组注射0.9 ml/100g，阴性对照组和正常对照组各注射生理盐水0.6 ml/100g。

大鼠脑缺血再灌注损伤模型制备方法为：

1.  参照Longa、Kuge等（详见参考文献：Kuge Y, Minematsu K, Yamaguchi T, et al. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke, 1995,26:1655-58）报道的方法，采用颈外动脉插入线栓法造模。SD大鼠用笑气/氧（70:30）加1%七氟烷麻醉，仰卧固定，颈正中切口，钝性分离暴露右侧颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉，结扎颈外动脉远端，游离其主干备用。尼龙线长40 mm，直径0.20~0.23 mm，一端约0.5 cm长度上均匀涂布聚胺酯轻漆，使其头端成一光滑的锥型，头端直径小于0.25 mm，从右侧颈外动脉入口，至右颈总动脉后，转向右颈内动脉入颅推进17~19 mm，微遇阻力时停止，完成一侧大脑中动脉的阻塞。再灌注时缓慢地轻拉线栓使其头端回到颈外动脉内，可实现大脑中动脉再灌注。本实验采用的动物模型均为缺血90分钟后再灌注。

上述各组大鼠在腹腔注射24小时后处死，分别取脑组织进行TTC、HE、尼氏、细胞凋亡染色，并提取海马和皮层脑区测定凋亡酶活性。实验结果如下：

1．观察对大鼠脑缺血再灌注后脑梗死体积的影响：

取各组动物脑组织，进行TTC染色，TTC染色是检测组织缺血梗死体积的经典方法，染色后缺血区显示为白色，正常组织为红色。结果见图1，图1中，A. 正常对照组；B. 阴性对照组；C. 本发明注射液中剂量治疗组。图1显示，阴性对照组梗死范围分布在缺血侧皮层、海马和尾核，本发明中剂量治疗组梗死范围仅出现在缺血侧部分皮层，表明本发明注射液可明显减少脑梗死体积。

2．观察对大鼠脑缺血再灌注后24小时脑皮层与海马神经元数量的影响：取各组动物脑组织，石蜡固定并切片，采用经典的尼氏染色（详见参考文献：Li Z, Liu W, Kang Z, Lv S, Han C, Yun L, Sun X, Zhang JH.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Brain Res. 2008; 1196(2): 151-156），结果见图2。由图2可见：与正常对照组相比，阴性对照组脑皮层与海马神经元明显减少，说明脑缺血再灌注后脑皮层与海马神经元出现明显损伤，本发明注射液低、中、高剂量对脑缺血再灌注后脑皮层与海马神经元均有改善，其中以中剂量0.6 ml/100g组作用最明显，神经元细胞数量和组织结构均接近正常对照组。结果表明，本发明注射液可减轻大鼠脑缺血再灌注后神经元损伤。

3. 观察对大鼠脑缺血再灌注后24小时脑皮层与海马细胞凋亡数量的影响：取各组动物脑组织，石蜡固定并切片，采用Tunel染色（详见参考文献：Li Z, Liu W, Kang Z, Lv S, Han C, Yun L, Sun X, Zhang JH.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Brain Res. 2008; 1196(2): 151-156），结果见图3，图3中分组同图2。由图3可见：本发明注射液低、中、高剂量对脑缺血再灌注后脑皮层与海马细胞凋亡数量减少，其中以中剂量组0.6 ml/100g作用最明显，接近于正常对照组水平。结果表明，本发明注射液可减轻大鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡。

4．观察对大鼠脑缺血再灌注后24小时脑皮层与海马凋亡酶活性的影响：取各组动物新鲜脑组织，采用荧光酶活性检测（详见参考文献：Li Z, Liu W, Kang Z, Lv S, Han C, Yun L, Sun X, Zhang JH.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Brain Res. 2008; 1196(2): 151-156），结果见图4。由图4可见：本发明注射液低、中、高剂量对脑缺血再灌注后脑皮层与海马凋亡酶活性明显减小，其中以中剂量组0.6 ml/100g作用最明显，接近于正常对照组水平。结果表明，本发明注射液可降低大鼠脑缺血再灌注后凋亡酶活性。

上述实验结果表明，本发明注射液可减少大鼠局灶性脑缺血后脑梗死体积、保护神经细胞损伤、减少细胞凋亡数量、降低皮层和海马凋亡酶活性，在心肌缺血再灌注、肾脏缺血再灌注和肝脏缺血再灌注损伤模型中观察到类似效果。所以本发明可用于治疗脑、心、肾等重要器官缺血再灌注损伤。

10年前德国关于含氢气药物的专利：德国

日本关于氢气抗氧化的专利

日本关于氢气用于肥胖治疗的专利

日本氢水制备专利

        日本氢水棒专利

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