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诺瓦克病毒(Norwalk virus,NV)和诺瓦克样病毒(Norwalk-like viruses,NLV)是一组世界范围内引起的急性无菌性胃肠炎的重要病原。诺瓦克病毒1968年在美国俄亥俄州诺瓦克镇一起腹泻暴发流行的患者粪便中发现并因此而得名;1990年Jiang等人克隆了诺瓦克病毒的全基因组并表达了其结构蛋白,获得了形态结构和生物学特征与天然病毒相似的病毒样颗粒,随着分子生物学和免疫学技术的发展,人们逐渐发现了一组与诺瓦克病毒形态接近、核苷酸同源性较高、但抗原性有一定差异的病毒,统称为诺瓦克样病毒。国际病毒分类学委员会(International Committee On Taxonomy Of Viruses,ICTV) 将这些病毒归类为同一属,暂定名“诺瓦克样病毒属” ,诺瓦克病毒为代表株之一。
生物学性状
诺瓦克病毒虽不具有杯状病毒的典型形态,但基因的测序分析结果发现它属于人类杯状病毒(human Caliciviruses,HuCV),在电镜下是有结构的小圆病毒(sma11 round structured virus,SRSV),直径27nm,呈二十面体对称,外壳是由180个同一种外壳蛋白组成的90个二聚体构成。有4个血清型:诺瓦克、夏威夷、雪山、陶顿(TauntonVires)。NV成员庞杂,目前已对其 100 多个分离株进行基因测序。核酸的同源性分析表明,世界不同地区、不同时间流行的NV基因RNA多聚酶区序列相对保守,核苷酸氨基酸序列同源性高于60%,有的达到90%以上。因此,根据 RNA 多聚酶区核苷酸序列的相似性,将 NLV 分为 5 个基因组,其中感染人的包括基因组Ⅰ、Ⅱ和IV:基因组Ⅰ,以 Norwalk virus(NV)为代表,包括Southampton(SOV)、Desert Shield virus(DSV)等;基因组Ⅱ,以 Snow Mountain virus(SMV)代表,包括 Hawaii Virus(HV)、Mexico Virus(MxV)、Lordsdale virus(LV)等;最近在动物体中发现了感染猪和奶牛的基因组属于基因组III和V。诺瓦克病毒(NV)和诺瓦克样病毒(NLV)有许多共同特征:①分离自急性胃肠炎病人的粪便;②直径26~35nm的小圆结构病毒,无包膜;③基因组为单股正链RNA;④不能在细胞或组织中培养;⑤在Cscl密度梯度中的浮力密度为(1.36~1.41)g/cm3;⑥电镜下缺乏显著的形态学特征。诺瓦克样病毒在经过下列处理后,仍具有感染性:室温,pH2.7环境中暴露3h;4℃,20%乙醚处理18h;或60℃孵育30min。在浓度3.75mg/L~6.25mg/L氯、游离氯离子浓度0.5mg/L~1.0mg/L的水溶液(相当于饮用水中的氯浓度)中,诺瓦克样病毒仍不被灭活;但可被10mg/L的氯的水溶液灭活。
NV基因组是单股正链 RNA,全长约7654nt,包括3 个开放阅读框(Open Reading Frames,ORFs)。ORF1编码包括保守的具有RNA 多聚酶在内的非结构蛋白;ORF2 编码分子量约为 56Kda的衣壳蛋白;ORF3 编码一种分子量约为 22.5Kda 的强碱性微小结构蛋白。Pamela等人研究发现ORF3表达的部分区域蛋白与衣壳蛋白发生交互作用,共同形成衣壳。
NV 浓缩方法一般分为两大类,一类为有机絮凝沉淀法,主要使用聚乙二醇(PEG)沉淀,PEG 是具有强烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物,先改变样品 pH 值,使毒粒与样品微粒分开,PEG 把病毒沉淀下来,达到浓缩的目的。目前对于固体样品 PEG 沉淀法是最有效的浓缩方法。 膜过滤法是另一类有效浓缩病毒的方法,通过改变膜的pH值使之与带有电荷的毒粒结合捕捉病毒,这种方法通常用在浓缩大体积的黏度小、内容颗粒小的液体食品或水中。检测海水、生活污水中的NV曾用过这种方法,为瓶装水和其他饮料浓缩NV提供了参考。NV是单链RNA病毒,核酸提取方法的优劣取决于两个方面:核酸的质量和去除抑制因子的能力。目前应用较成熟广泛的是胍法 RNA 提取法,即(异)硫氰酸胍-苯酚-氯仿联合裂解抽提法,该方法改进后制成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec 等产品,与石英砂、磁珠等多孔颗粒相结合,已结合了poly(dT) 或特异探针的磁珠能较高程度的提纯mRNA,去除反应抑制因子。石英砂或磁珠纯化 RNA与传统的有机试剂(异丙醇、乙醇)沉淀 RNA 相比起来,效果较好,只是成本偏高。
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GMT+8, 2024-10-20 03:24
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