科研经历回顾之二：博士研究生经历

硕士毕业后，我到上海一家科研技术服务公司做平台主管，主要是指导技术员做实验及承接公司其他部门的部分工作，但是因为我硕士学位还没有拿到，有点影响我的积极性，只干了两个月就回老家了，回到老家学了个驾照，然后又想着该找份工作，就去了苏州一家刚成立的公司，但那公司没开始运作，老板也没决定好怎么做，主要是钱没搞定，做了大概半年多，我想着这样子下去太无聊太没前景了，读博士才能有机会做独立的课题及项目，就开始联系合作导师，主要联系的是北京的。但是我发出去的电子邮件给我一种奇怪的感觉，我联系的导师大部分都很快回复了我的邮件并表示欢迎，回复拒绝的也比较客气，就在我觉得有了准备方向的时候有些表示欢迎的老师突然画风突转，找了个理由就拒绝了，我感到很困惑，不知道中间出现了什么问题，有时候觉得是不是交流的邮件出了什么问题，想不明白，那个时候不知道网络交流那么容易地就被人截胡或偷看，好在有几个老师依然保持了开放态度，想着杭州离苏州近，杭州那个老师也欢迎提前过去看看，我就去杭州待了几个月，后来还是决定去北京更好些，春节前就去了北京准备博士入学考试，考完笔试还找了个技术服务的工作做了两三个月，参加复试被录取后很快就入学了。

博士导师招我一个主要的理由可能是我有硕士期间研究细胞自噬的背景，博导正好与其他老师合作拿了一个比较大的项目，我读博士的目的就是提升资历留在北京找个好工作，做熟悉的课题对我顺利毕业也有好处，很快就开始做实验了。刚开始去亦庄那边的一个合作实验室构建筛选的平台，细胞自噬研究是个很简单的方向，检测手段及对象定好了，很容易就能有新发现，加一点机制研究就能发文章，这个领域的文章不论大小基本都是这个套路，那几年也出了一些筛选方面的文章，基本上也是构建一个筛选平台筛个库，就能出新发现新结果，我们的思路也是一样的，只是筛选平台和库不一样。我构建了两个筛选质粒，都是以自噬底物p62为基础，只不过融合的筛选标记不一样，一个是GFP-p62，一个是luciferase-p62，两个都能很好地反应细胞内的自噬水平，但是GFP需要用比较好的荧光显微镜看，虽然可以自动化逐孔扫多孔板，但每块多孔板的检测时间比较长，如果用高内涵平台又需要去另一个校区，比较麻烦，而荧光素酶的检测就简单快速得多，导师实验室有现成的一台检测仪，比较方便，最后选择了luciferase-p62这个监测方式，并且构建了稳定表达这个重组蛋白的细胞系。

在合作实验室初筛的时候，之前他们也做了一些自噬的研究，并发现了一个调控自噬的新基因，我想着GFP-p62这个也不浪费，如果结合那个新基因，合到一起可以发篇文章，但负责合作实验室的师兄不同意，我很奇怪他为什么不同意，因为他很看重文章之类的成果，只要大团队有谁要发文章或申请专利他都想尽办法要把他的名字加进去，这么容易的通讯作者文章他竟然拒绝了。后来一个同事给我看了一个测序文件我才发现表达那个新基因的质粒可能混了其他质粒，因为测序峰图上明显有两个同步但不一样的结果，我也就作罢了，不再想着发这个文章。

然后我就专心luciferase-p62用于筛选的工作了，虽然那段时间更常见的是用基因组宽度的siRNA或shRNA进行筛选，但由于要结合实验室已有资源，实验室有不少过表达质粒，我也构建了几十个新的表达质粒，就采用了过表达的方式来进行筛选。设置了一些前置条件后，大大缩小了筛选的过表达质粒库，一共筛选了几百个基因，也得到了十多个新的自噬调控基因。这个筛选工作只是初步工作，筛出来的基因还需要验证，其中一个验证出来的结果正好是相反的（促进自噬/抑制自噬），也许是筛选用的过表达质粒和单独验证的质粒的载体及插入片段不一样导致，筛选用的过表达质粒插入的是包含CDS区在内的更长的cDNA区域，而单独验证的质粒插入的片段只有CDS，两个质粒载体也不一样，不管是促进还是抑制，筛选平台把他筛选出来了，而筛选的目的就是寻找改变细胞自噬水平的新调控基因，所以目的是达到了，虽然验证的结果有点意外。

筛选出来的十多个基因，我只研究了其中一个来得巧合的膜蛋白TMEM208，但我没预料到这个基因不太好研究，在研究这个基因调控细胞自噬机制的过程中，我们用细胞自噬的两种抑制剂有时候竟然得到了相反的结果，最后我决定只用一种结果，另一个结果就不考虑了，毕竟我只是想顺利博士毕业。 最后，在寻找这个基因调控细胞自噬的机制上，我没有找到一个完美或充分的解释，而仅仅是做了一些推测就发表了【4】，博士答辩的时候，有答辩老师问我为什么不投个好点的杂志，他认为至少可以发表在《autophagy》上，当时我只想着达到毕业要求尽快毕业就行了，顺利毕业更重要，我似乎和有的专业杂志无缘，也许是我太急于求成，而忽略了更长远的作用。在我博士毕业后三年，第二篇关于这个基因的研究文章发表了，一篇Nature【5】的文章利用酵母作为研究工具，发现了这个基因的新功能，也就是真核生物细胞质中mRNA翻译中或翻译后向内质网转位的第三种途径，而我认为这个新功能更像是这个基因的的真正功能，后来我跟进证实了Nature文章的结论。有点庆幸当年没有死磕这个基因发挥功能的分子机制，不然按我们当时的条件及研究侧重点，大概率不可能发现Nature那篇文章的研究结论的。

我拿到硕士学位花了差不多四年，博士三年就顺利毕业了，我读博士的初步目标完成了，但我遗憾地没有留在北京工作，而是抱着出国继续深造几年做点更好的成果的想法选择了出国继续做科研。

这篇文章就不放研究结果图了，因为仅仅博士论文的图片就比硕士论文的多太多了，还有很多结果没有放到博士论文里面，期间我也做了很多帮助了不少同门顺利毕业的工作，总体工作量不比五年博士研究生的少。我的硕士论文和博士论文都可以在论文数据库里看到全文，虽不太满意但依然觉得自己的劳动成果是有意义的。

参考

1、博士论文：人类自噬相关基因的筛选及TMEM208和RNF121的功能研究 （2013）

2、基于 p62/SQSTM1-luciferase 的细胞自噬水平检测方法的建立及鉴定 中国生物工程杂志 2016, 36(1):55-62

3、RNF121, a Golgi-located protein, regulates cell apoptosis dependent on its RING-domain. Acta Biochim Biophys Sin 46 (2014) : 668–674.

4、An ER-localized protein, transmembrane protein 208, regulates autophagy and ER stress. PLoS ONE 8(5): e64228. (2013)

5、Aviram N, Ast T, Costa EA, Arakel EC, Chuartzman SG, Jan CH, Hassdenteufel S, et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature 2016, 540: 134–138.

6、hSnd2/TMEM208 is a HIF-1 α targeted gene and contains a WH2 motif, Acta Biochimica et Biophysica Sinica (2020), doi : 10.1093/abbs/gmz157.

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