研究内容

该研究围绕Azinothricin类天然产物的系统挖掘展开，借助cblaster工具进行基因组挖掘，共鉴定出137个候选Azinothricin型生物合成基因簇（BGC），构建了该类天然产物生物合成基因簇的“分子图谱”，并首次从链霉菌Streptomyces durmitorensis DSM 41863中鉴定出kettapeptin，拓展了该家族化合物的遗传多样性。

Azinothricin家族化合物在结构上通常由六个非蛋白氨基酸组成的19元大环肽骨架，以及一条碳数不等的聚酮侧链构成，是典型的PKS-NRPS杂合天然产物。目前已报道数十个成员，包括azinothricin、mollemycin A、kettapeptin、aurantimycin、diperamycin及verucopeptin等。该家族化合物展现出广谱生物活性，包括抗菌、抗肿瘤、抗疟疾、抗炎活性等，是极具开发潜力的候选药物骨架。在生物合成层面，这类化合物通常由I型聚酮合酶（PKS）与非核糖体肽合成酶（NRPS）模块化协同装配。然而，目前仅有少数成员完成了生物合成基因簇的解析，大量潜在基因簇仍隐藏于链霉菌基因组中，有待系统挖掘和功能验证。

针对这一问题，研究团队以mollemycin A生物合成关键基因为探针，建立了基因组挖掘策略。通过cblaster在NCBI公开的链霉菌基因组数据库中进行高通量筛选，并设置同源基因数量、序列一致性及基因间距等严格参数阈值，最终鉴定出137个候选Azinothricin型BGC（图1），这一结果显著扩展了该类天然产物的潜在遗传资源库。

图1：基于cblaster基因组挖掘的42个评分最高的Azinothricin型生物合成基因簇

进一步的基因组分析显示，这些候选BGC呈现出多样化的特征：包括NRPS模块缺失或重复、PKS模块扩增，以及个别簇中出现糖基转移酶编码基因等。其中最引人关注的是两株链霉菌中出现的PKS模块扩增现象，其第二个PKS蛋白包含四个延伸模块，使整个聚酮装配线达到七个延伸模块，明显区别于已报道基因簇的Azinothricin家族成员。这种模块扩展预示其可能合成具有更长或结构修饰差异的聚酮侧链衍生物。

基于上述分析，研究团队优先选择Streptomyces durmitorensis DSM 41863开展代谢产物挖掘。该菌此前尚未发现Azinothricin类化合物。在固态GYM培养条件下，通过LC-MS检测到分子量约1006 Da的特征峰，提示可能为目标家族成员。

为验证该代谢物与预测BGC之间的关联，团队利用CRISPR-BEST系统对PKS核心基因ketU进行敲除。LC-MS比较结果显示，野生型菌株中存在的目标峰在ΔketU突变株中完全消失，直接证明该BGC负责该化合物的生物合成。随后通过规模化发酵与多步纯化分离获得14 mg纯品，经HRESIMS与NMR数据比对，确认其为kettapeptin。这是该化合物首次在S. durmitorensis中被报道。

除主产物kettapeptin外，研究还通过MS/MS分析检测到三个结构类似物，其分子量相对于kettapeptin呈±14 Da差异，提示其聚酮侧链长度存在一个亚甲基单元的变化。这一结构差异与PKS中某些酰基转移酶（AT）结构域活性位点氨基酸替换（如YASH变为VASH）可能导致的底物选择性变化高度吻合，从分子机制层面解释了产物结构微调的来源。

在生物合成机制方面，研究团队对kettapeptin的生物合成路径进行推测（图2）：ketT–ketW编码的I型PKS负责构建聚酮侧链，ketX–ketH编码的NRPS模块组装六元肽核心，ketK与ketL参与哌嗪酸形成，ketO1等P450氧化酶完成后修饰步骤。通过对ketO1基因的敲除与互补实验，进一步从遗传学层面验证了该生物合成路径的正确性。

值得注意的是，在优化条件下，kettapeptin产量可达52 mg·L-1，成为该菌株的优势代谢物，这为后续结构修饰与组合生物合成提供了良好底盘。

综上所述，本研究通过基因组挖掘策略，构建了Azinothricin类天然产物的分子景观图谱，并在S. durmitorensis中实现了从基因预测、遗传验证到化合物分离鉴定的完整研究链条。该工作显著拓展了Azinothricin家族的化学与遗传空间，为基于模块工程的结构多样化改造与新药先导分子开发奠定了坚实基础。

原文信息

Molecular landscape analysis of azinothricin-type natural products enables the identification of kettapeptin from Streptomyces durmitorensis

Huixue Chen, Yan Gao, Shixue Jin, Qian Yun, Xinchen Ruan, Xudong Qu, Chun Lei

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.synbio.2025.12.013