代谢学人

Cell Metabolism：胆碱转运供碳新，线粒体中贯通循

撰文 | 程诗淼 高铭远 生茂正 郭盈盈 于剑 

编辑 | 孟美瑶

校对 | 生茂正

背景介绍

线粒体不仅能够产生ATP，而且在分解代谢、合成和通过区室化代谢调节各种代谢过程中具有至关重要的作用。不同类型细胞的线粒体通过产生多种代谢物和信号分子响应细胞的代谢需求。线粒体区室代谢物的进出受到线粒体内膜(Inner mitochondrial membrane, IMM)的严格调控，但由于代谢物无法直接透过IMM，因此穿过IMM的代谢物转运依赖于特定的膜结合载体蛋白。其中溶质载体家族25A(Solute carrier family 25 member, SLC25A)蛋白属于最大的载体蛋白家族，主要定位于IMM。然而该家族的许多成员被认为是“孤儿”载体，其底物特异性和生物学功能尚未被表征。

胆碱是一种分解代谢产物，其来源主要来自于食物中摄取。此外，在脂肪酸代谢中生成的磷酸酰乙醇胺经连续甲基化后，生成磷脂酰胆碱，并进一步分解产生少量内源性胆碱。但磷酸酰乙醇胺甲基化合成胆碱水平往往不能满足人体或动物需要，通常为植物的胆碱主要来源。胆碱主要进入线粒体发挥作用，其不仅促进磷脂和神经递质的合成，而且是细胞内主要的单碳供体。胆碱在线粒体中经过胆碱脱氢酶(Choline dehydrogenase, CHDH)的作用转化为中间产物甜菜碱醛，然后再由醛脱氢酶7家族成员A1(Aldehyde dehydrogenase 7 family member A1, ALDH7A1)将其转化为甜菜碱，随后线粒体中的甜菜碱被转运到胞质作为用于合成蛋氨酸的甲基供体。胆碱和甜菜碱在线粒体膜上的动态交换是由IMM结合的载体蛋白介导的，但具体的参与蛋白尚不清楚。棕色脂肪组织高度富集线粒体，其中许多IMM蛋白大量表达。此外，棕色脂肪细胞表现出独特的特征，包括致密的嵴结构，线粒体解偶联呼吸和产热作用，这些都是确定未表征的IMM蛋白生物学功能的有用指标。为了探索胆碱依赖于线粒体的代谢机制，美国哈佛大学霍华德休斯医学研究所Shingo Kajimura团队进行相关研究，其成果“SLC25A48 controls mitochondrial choline import and metabolism”近期发表在Cell Metabolism上，该研究发现之前未被表征的线粒体内膜载体蛋白SLC25A48，该蛋白能够控制线粒体胆碱运输和胆碱衍生物的合成代谢，在维持线粒体呼吸和线粒体膜完整性方面起到关键作用。

敲黑板啦！

1、SLC25A48是线粒体胆碱摄取和甜菜碱合成所必需的

2、SLC25A48缺失可诱导线粒体氧化应激和呼吸损伤

3、SLC25A48控制胆碱对嘌呤核苷酸合成的贡献

4、癌细胞需要通过SLC25A48进行线粒体胆碱代谢才能存活

研究结果

1、SLC15A48是BAT产热和线粒体膜完整性所必需

研究人员首先利用定量串联质量标签蛋白质组学对普通饮食或高脂饮食喂养8周的野生型雄性小鼠BAT中的线粒体蛋白进行鉴定，分析发现几种在HFD饮食中下调的线粒体蛋白，包括柠檬酸载体SLC25A1、二羧酸载体SLC25A10、谷氨酸载体SLC25A22和与Graves病相关的载体SLC25A16，而SLC25A48是唯一响应HFD而显著上调的SLC25A蛋白(图1A)。SLC25A48在肝脏、肾脏以及BAT中高表达，但在心脏和比目鱼肌等同样富含高水平线粒体的组织中几乎不表达(图S1A)。为了确定SLC25A48的细胞定位，研究人员对带FLAG标签表达SLC25A4的棕色前脂肪细胞进行了高分辨率显微镜观察，并探测了质膜标记物(小麦胚芽凝集素[WGA])（小编注：WGA是一种细胞不可渗透性染色剂，可选择性地与细胞膜上常见的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰神经氨酸残基结合，而N-乙酰葡糖胺和N-乙酰神经氨酸选择性地与细胞膜上的蛋白结合，故出现在高倍镜下WGA标记呈现点状分布的特点。此外，WGA并未出现在线粒体上，其主要结合在细胞膜上，但如果在细胞发生透化后进行染色，由于细胞核膜上也存在N-乙酰葡糖胺，因此WGA有可能会在细胞核上出现非特异性结合）、线粒体标记物TOM20和抗FLAG的SLC25A48(图1B)，研究发现SLC25A48的信号不与质膜标记物WGA重叠，而与线粒体标记物TOM20一致。高分辨率共定位分析显示，SLC25A48不与OMM共定位，但在OMM膜之间发现信号。然后研究人员在表达对照空载体或SLC25A48-FLAG的棕色脂肪细胞分离的线粒体中进行蛋白酶降解试验，发现在蛋白酶K处理的线粒体中，OMM标记物TOM20被降解，而IMM标记物ATP合成酶F1亚基α(ATP synthase F1 subunit alpha,ATP5A)未被破坏，表明IMM是完整的。SLC25A48的表达存在于线粒体部分，且未被蛋白酶K处理降解(图S1B)。上述结果表明SLC25A48定位于IMM，并且在棕色脂肪细胞分化过程中，Slc25A48 mRNA的表达被高度诱导(图S1C)。

为了探究SLC25A48在体内的作用，研究人员构建了缺失外显子4的SLC25A48敲除小鼠，该外显子4编码六个跨膜结构域中的两个(图S1D)。研究人员将SLC25A48杂合缺失的小鼠杂交以产生同窝对照和SLC25A48纯合缺失(SLC25A48-KO)的小鼠(图1C、图S1E)。与对照组相比，SLC25A48-KO的雄性和雌性小鼠发育正常，且体重和空腹血糖没有明显差异(图S1F、G)，但耐寒性明显受损(图1D)。虽然BAT的大体形态在基因型间没有差异(图S1H)，但电镜分析发现与对照组相比，SLC25A48-KO 小鼠BAT的线粒体超微结构增大，嵴密度降低(图1E)。并且与对照相比，雄性SLC25A48-KO小鼠分离的BAT线粒体中复合体I和II介导的呼吸明显减弱，说明BAT产热功能存在缺陷(图1F)。在GDP存在的情况下，研究人员未观察到呼吸速率的差异，这表明UCP1介导的产热作用在SLC25A48-KO小鼠的BAT中被减弱，在雌鼠同样如此(图S1I)。BAT产热功能受损不是由于UCP1和线粒体OXPHOS蛋白的改变(图S1J、K)。此外，SLC25A48的遗传缺失导致复合物I和II活性受损，这表明SLC25A48的缺失可能导致线粒体膜的电子泄漏。为了验证这一点，研究人员通过使用过氧化物酶底物探针Amplex Red，测量了从BAT分离的线粒体呼吸作用。这些底物可以和H2O2结合产生红色荧光物质试卤灵(Resorufin)。为了测定最大H2O2产量(JH2O2)，研究人员还使用了金诺芬抑制硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase, TR)，从而防止H2O2被额外消耗。实验结果表明，SLC25A48-KO小鼠BAT中线粒体H2O2产量明显高于对照小鼠(图1G)。

接下来，研究人员探究了SLC25A48是否控制线粒体维持脂质完整性，以获得最佳的电子流。BAT来源线粒体的脂质组学显示，SLC25A48缺失导致与脂质过氧化和ROS积累增加相关的己糖神经酰胺(HexlCers)升高(图1H)。而部分HexlCers含有氧加合物，表明SLC25A48-KO BAT线粒体氧化应激水平升高。不仅如此，SLC25A48-KO BAT中神经酰胺水平也显著升高，其可以通过抑制复合体III和调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)磷酸氧化酶参与线粒体ROS的产生。此外，SLC25A48-KO线粒体中一些膜结构磷脂，如磷脂酰胆碱(Phosphatidyl choline, PC)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl ethanolamine, PE)的丰度也发生改变。例如，在Sn-2位置(18:0_22:6和18:1_22:6)上具有超长链多不饱和脂肪酸的PE在SLC25A48-KO线粒体中表达水平升高，而PC(16:0_22:4和18:2_20:2)在SLC25A48-KO小鼠中减少。这些变化似乎对神经酰胺和PC/PE脂质具有选择性，因为心磷脂(一种众所周知的线粒体膜脂)在不同基因型的BAT中无差异。与线粒体H2O2产量升高一致，SLC25A48-KO小鼠的血清中脂质过氧化标志物丙二醛(MDA)水平高于对照小鼠(图1I)。这些数据表明，SLC25A48通过调控线粒体膜脂类维持线粒体中最佳电子流。

拓展阅读

甘油磷脂和鞘磷脂

构成膜结构的脂质包括磷脂、糖脂、胆固醇，其中磷脂含量最高，约占膜脂的75%以上；糖脂普遍存在于原核和真核细胞质膜上，在调节膜的流动性，增加膜的稳定性以及降低水溶性物质的通透性等方面具有重要作用。

磷脂主要包括甘油磷脂和鞘磷脂两大类。甘油磷脂中，甘油的两个羟基(C1和C2位)和脂肪酸形成酯，第三个羟基(C3位)被磷酸酯化，生成磷脂酸。在该结构中，作为三元酸的磷酸提供了两个羟基(-OH)，其中一个羟基(-OH)与甘油结合形成甘油磷脂酸，而另一个羟基则被胆碱、丝氨酸等极性基团取代。不同的取代基团形成不同的甘油磷脂，如胆碱和磷脂酸形成磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine, PC)，乙醇胺和磷脂酸形成磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine, PE)。这些磷脂具有一个与磷酸基团相结合的极性头和两个非极性的尾（脂肪酸链）。但除这些甘油磷酸外，也存在心磷脂(cardiolipin, CL)这种甘油的C1和C3位均被磷脂酸取代的非极性磷脂，这些心磷脂广泛存在于线粒体内膜，是线粒体高度弯曲的嵴膜的结构和功能的基础。此外，在线粒体中，PC/PE的比例也会显著影响线粒体功能。已有研究表明，线粒体的PE含量和肝细胞的ATP含量成显著正相关，而当PE含量过低且PC含量偏高时，线粒体结构出现碎片化，细胞的生长也被严重抑制。

与甘油磷脂不同，鞘磷脂(Sphingolipids)是一类含有鞘氨醇骨架的两性脂，其前体神经酰胺则是由长链脂肪酸的羧基与鞘氨醇的C2位的氨基经脱水而形成的一类酰胺化合物，神经酰胺与磷脂酰胆碱一起合成鞘磷脂，起到支撑细胞膜、参与细胞生长分化等功能。

参考文献：

[1]Wiedeman AM et al.  Nutrients. 2018 Oct 16;10(10):1513.

[2]Zeisel SH et al.  Nutr Rev. 2009 Nov;67(11):615-23. 

除此之外，研究人员发现SLC25A48调节全身胆碱代谢水平。与对照小鼠相比，SLC25A48-KO小鼠血清中胆碱水平显著升高，而作为胆碱衍生代谢物的甜菜碱和二甲基甘氨酸显著降低(图1J)。甜菜碱和蛋氨酸代谢是所有差异丰度代谢物中富集程度最高的两条代谢途径(图S1L)。

图1.SLC25A48是体内BAT产热和线粒体膜完整性所必需的

图S1.SLC25A48 KO小鼠分析

2、SLC15A48在调节胆碱代谢中的细胞自主作用

为进一步探究SLC25A48-KO小鼠BAT产热缺陷是否由棕色脂肪细胞自主调控，研究人员从SLC25A48-KO BAT的基质血管部分建立了稳定的棕色脂肪细胞，然后将人SLC25A48-FLAG cDNA重新导入SLC25A48-KO永生化细胞中，建立SLC25A48回补细胞(图S2A)。研究人员发现SLC25A48-KO细胞和SLC25A48回补细胞在棕色脂肪生成或分化方面没有差异(图S2B、C)。然而与SLC25A48回补细胞相比，SLC25A48-KO细胞中去甲肾上腺素刺激的细胞呼吸，无论是总呼吸还是不依赖寡霉素的呼吸都显著降低（小编注：加入寡霉素会抑制ATP合酶，这时OCR显著下降，仅余下质子渗漏造成的耗氧率，质子梯度的能量以热量形式，而不是用于ATP合成，因此不依赖寡霉素的呼吸显著降低说明线粒体的产热功能下降）(图2A)。羰基氰对三氟甲氧基苯腙(Carbonylcyanide-p-trifluoromethoxuphenylhydrazone,FCCP)诱导的SLC25A48-KO细胞的最大呼吸能力显著低于SLC25A48回补细胞，而两组间线粒体OXPHOS蛋白表达和细胞外酸化率没有差异（小编注：细胞外酸化率（Extracellular Acidification Rate,ECAR）是衡量细胞代谢过程中产生的酸性物质释放到细胞外环境速率的一个指标。它通常用于评估细胞的糖酵解活性,细胞外酸化率没有差异，说明两组间通过糖酵解合成ATP的速率相似）(图S2D、E)。在基础和最大条件下，SLC25A48-KO棕色脂肪细胞的线粒体H₂O₂产量均显著高于回补细胞(图2B)。上述结果表明SLC25A48在细胞呼吸中具有细胞自主功能。

接下来研究人员对蛋白质组结果进行系统发育分析，分析基于在相同途径中起作用的蛋白质，并根据这些蛋白质在系统发育分支上的序列保守模式确定蛋白质的相似保守情况。分析一系列真核生物序列保守模式的相似性可以预测以前未表征的蛋白质与已知途径的功能连接。跨物种与SLC25A48共进化基因的系统发育分析显示，腺苷同型半胱氨酸酶(AHCY)是在人类中排名第一，在小鼠中排名第二的共进化基因，而超氧化物歧化酶2(SOD2)是在小鼠中排名第一，在人类中排名第二的共进化基因（小编注：共同进化是指一个基因的变化与另一个基因的变化相关联。这可以表明这两个基因以某种重要方式连锁在一起。一个基因进化改变后会引起另一个基因的进化，从而维持两者间相互作用的能力，此处作者认为AHCY和SOD2是与SLC25A48密切相关的蛋白）(图2C)。SOD2定位于线粒体基质并将超氧阴离子转化为H₂O₂，这与SLC25A48参与线粒体H₂O₂的产生相一致。AHCY参与单碳蛋氨酸循环并催化可逆水解反应，将S-腺苷型同型半胱氨酸(S-Adenosylhomocysteine, SAH)转化为同型半胱氨酸和腺苷。对前25个共进化基因的基因本体分析表明单碳循环途径高度富集(图S2F)。而哺乳动物细胞中的单碳单位来自胆碱、丝氨酸和甘氨酸，所有这些都被输入到线粒体中参与代谢（小编注：甜菜碱在叶酸循环中起到替代叶酸循环中10-甲酰基-THF作为甲基供体的作用，胆碱在线粒体中主要即被氧化形成甜菜碱）并进入叶酸循环以合成嘌呤核苷酸。

嘌呤合成发生在细胞质中，而线粒体胆碱代谢有助于甲酸盐的合成(图2D)。具体而言，胆碱上的碳结合在三甲基-甘氨酸产物的主链中，并在线粒体基质中的甘氨酸裂解系统中释放。甘氨酸裂解系统将甘氨酸分解成CO₂、氨、N⁵和N¹⁰-亚甲基-四氢叶酸(5,10-meTHF)。5,10-meTHF中的碳进入叶酸循环，并以甲酸盐的形式提供一个单碳单元，用于在C2和C8处合成嘌呤。为了探究SLC25A48是否参与单碳代谢途径，研究人员在全细胞和分离的线粒体中进行了液相色谱-质谱(LCMS)代谢组学研究。通过线粒体定位表位标签MITO-Tag表达系统（小编注：将MitoTag-Flox小鼠与组织特异性表达Cre的小鼠进行杂交，繁殖出组织特异性表达MitoTag的小鼠，该Cre小鼠的特定组织中线粒体外膜表达eGFP，随后通过高亲和力磁免疫捕获技术从组织中纯化出带有标记的线粒体，因此该系统可以组织特异性分离完整和功能正常的线粒体）进行快速的线粒体分离和代谢物分析。在全细胞中，研究人员观察到与回补组相比，SLC25A48-KO细胞中还原型甜菜碱是差异最大的代谢物(图2E)。SLC25A48下调代谢物的通路分析表明，除了嘌呤代谢外，SLC25A48-KO细胞中TCA循环、CoA生物合成以及乙醛酸和二羧酸盐代谢也下调(图2F、G)。SLC25A48上调代谢物通路分析还表明，SLC25A48是蛋氨酸代谢和同型半胱氨酸降解的介质，而这两者都与胆碱代谢有关。在分离的线粒体中，SLC25A48-KO细胞中甜菜碱醛和甜菜碱等胆碱降解代谢物水平明显低于SLC25A48回补细胞(图2G)。SLC25A48-KO线粒体含有较低水平的腺嘌呤、单磷酸腺苷(AMP)、dAMP、单磷酸肌苷(IMP)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等嘌呤核苷酸。此外，还原型富马酸和FAD水平的降低也与SLC25A48-KO棕色脂肪细胞中线粒体复合物II活性的降低相一致。不仅如此，与SLC25A48回补细胞相比，SLC25A48-KO细胞的线粒体NAD和NAD磷酸盐(NADPH)含量也显著降低。相比之下，研究人员没有发现胞苷二磷酸(CDP)、胞苷一磷酸(CMP)和尿苷二磷酸(UDP)等嘧啶含量的差异。（小编注：一碳循环在嘧啶合成中主要功能为将dUMP甲基化生成dTMP。相较于嘌呤合成，嘧啶合成步骤较为简单，且对碳供体的需求较低(dUMP、UDP、CMP、CDP等不需要一碳单位供体)，仅dTMP需要一碳单位供体，其他原料谷氨酰胺和天冬氨酸也存在其他获取途径，并非如嘌呤合成一样刚需一碳单位，因此作者检测的这些嘧啶没有显著差异）

接下来，研究人员使用稳定标记的胆碱(¹³C₂-choline)进行胆碱示踪，通过MS检测M+1标记的嘌呤核苷酸，以确定胆碱分解代谢对嘌呤合成的贡献。研究人员发现与SLC25A48回补细胞相比，SLC25A48-KO细胞含有明显较低水平的腺苷、AMP和鸟嘌呤等胆碱衍生¹³C标记的嘌呤核苷酸(图2H)。这些数据表明，来自胆碱的一碳单元有助于嘌呤核苷酸的合成，并且SLC25A48参与了该过程。

图2.SLC25A48在调节胆碱代谢中的细胞自主作用

图S2.SLC25A48对棕色脂肪细胞的细胞自主调控

3、SLC15A48是线粒体胆碱输入和分解代谢所必需的

上述数据让研究人员提出了一个假设，即SLC25A48调节线粒体中胆碱衍生代谢物产生。为了验证这一假设，研究人员利用HEK293T细胞中制造出SLC25A48-KO和SLC25A48回补细胞(图S3A)，发现SLC25A48回补细胞只在线粒体IMM中表达SLC25A48(图S3B)。然后研究人员将这些细胞与20 mM的高标记胆碱(Choline-d9)共同孵育，以评估细胞胆碱摄取和甜菜碱生成能力。在孵育5分钟内，SLC25A48回补细胞中胆碱衍生的甜菜碱(M+9)的生成明显高于对照组，而在孵育的前5-15分钟细胞胆碱摄取没有统计学差异(图3A)。在孵育30分钟及之后的较晚时间点，SLC25A48回补细胞的胆碱摄取率高于对照组。

接下来，研究人员将分离的线粒体与5 nM放射性(³H)标记的胆碱在生理水平(10 mM)或过量(1 mM)未标记胆碱存在下孵育5分钟，洗涤后评估线粒体中的放射性活性。与内源性SLC25A48表达的野生型对照相比，SLC25A48-KO线粒体胆碱摄取显著降低，而SLC25A48的表达显著增加线粒体胆碱摄取(图3B)。当与过量(1 mM)未标记的胆碱共孵育时，所有组的³H-胆碱信号都显著降低，这验证了胆碱信号的特异性。接下来研究人员用高标记胆碱在1-100 mM（小编注：与普通胆碱相比，高标记胆碱(d9-Choline)中有9个H原子被同位素氘取代，所以胆碱衍生的d9-甜菜碱为M+9。研究人员分别检测了0.1、1、10和100mM d9-Choline下d9-甜菜碱(M+9)水平）下孵育分离的线粒体。在孵育15分钟后，洗去标记的胆碱并在线粒体颗粒和实验缓冲液中检测d9-甜菜碱(M+9)水平(图3C)。与SLC25A48-KO相比，SLC25A48回补的线粒体颗粒和缓冲液中的d9-甜菜碱水平均显著提高(图3D)。上述结果表明胆碱在线粒体内转化为甜菜碱并输出到线粒体外。高标记胆碱(20 mM)的时程分析实验表明，胆碱向甜菜碱的转化发生在5分钟内，并以时间依赖性方式继续增加(图3E)。为了进一步确定胆碱衍生的甜菜碱合成是发生在线粒体内还是在细胞质中，研究人员分离出线粒体部分或在胞质蛋白中含有质膜、高尔基体和内质网但缺乏线粒体的细胞质部分。随后，研究人员将分离的线粒体或细胞质与d9-胆碱孵育以检测d9-甜菜碱(图3F)，发现d9甜菜碱存在于线粒体而非细胞质(图3G、H)。上述结果表明，线粒体胆碱摄取主要有助于线粒体内甜菜碱的合成。

与之相对的是，以下实验表明SLC25A48不参与线粒体FAD输入（小编注：在前文中作者进行了代谢组学分析，发现SLC25A48-KO 线粒体含有低水平的FAD，该物质主要负责参与细胞内氧化还原及线粒体中的电子传递系统。且同家族的叶酸转运蛋白SLC25A32主要功能为负责将四氢叶酸和FAD从细胞质转运到线粒体以调控线粒体一碳代谢。因此这里想要检测其是否与FAD转运有关），SLC25A48-KO线粒体表现出FAD水平降低。研究人员用¹³C₄, ¹⁵N₂-核黄素(M+6)处理SLC25A48-KO和回补细胞4小时，然后在全细胞和线粒体层面进行代谢组学分析(图S3C)。在全细胞组分中，SLC25A48-KO细胞中未标记的(M+0)FAD水平有降低的趋势，而标记的部分(M+6)未发生变化(图S3D)。在线粒体组分中，未标记的FAD也显著减少，而标记的FAD水平在两组之间没有差异(图S3E)。这表明SLC25A48-KO细胞中线粒体FAD丰度较低可能由于嘌呤核苷酸合成减少，而不是由于核黄素对FAD的通量或FAD的线粒体输入的变化。

图3.SLC25A48是线粒体胆碱输入和代谢所必需的

图S3.SLC25A48线粒体代谢物摄取测定

4、线粒体胆碱分解代谢通过SLC25A48调控细胞增殖和存活

来自6136名芬兰男性参与者的代谢组学全基因组关联研究(GWASs)为SLC25A48在胆碱代谢中的作用提供新见解。数据发现血浆胆碱水平与SLC25A48基因位点之间存在很强的相关性，其中SLC25A48(rs200164783)是整个基因组中胆碱最显著的SNP(p=2.3e-33)(图4A)。rs200164783 SNP在评估的1391种代谢物中对循环胆碱变化具有高度特异性(图4B)。该SNP可能改变位于SLC25A48内含子4第30端(AG>GG)的预测剪接受体位点，该位点在哺乳动物中进化保守(图S4A)。为了探究这种多态性功能后果，研究人员使用具有同源定向修复的CRISPR-Cas9基因组编辑技术将SLC25A48(A>G) rs200164783引入HEK293细胞(图S4B)。除了SNP(A>G)替换外，研究人员还突变了PAM位点，以降低转染细胞中Cas9蛋白二次切割的概率（小编注：PAM序列是一个短的DNA序列，可以帮助Cas9核酸酶识别和切割目标DNA序列。将对应sgRNA的PAM或邻近PAM的序列进行同义突变，以防止插入基因组前后被CAS9错误识别并在修复后重新切割。该步骤可降低错误切割的概率，通常在KI等需要在修复后形成特定序列的模型中使用，在KO等不需要定向修复的模型中则并不需要），同时保持SLC25A48的丙氨酸氨基酸编码序列相同(GCC>GCG)。野生型对照细胞来源于与SNP敲入蛋白(SNP-KI)细胞相同的亲本细胞群，但缺乏sgRNA和GFP转染基因。随后，研究人员通过Sanger测序证实了这些细胞中的A>G编辑(图4C)。SNP-KI细胞来源的cDNA在正向和反向链上都跳过了外显子5序列。跨越外显子4-5连接处的qPCR引物证实SNP-KI细胞中外显子5的缺失，而在对照细胞中未缺失(图4D)。这表明rs200164783(A>G)导致编码SLC25A48蛋白的2个跨膜结构域的外显子5全缺失(图S4C)。

为了检验SLC25A48 SNP rs200164783(A>G)的功能后果，研究人员检测了SNP-KI细胞和野生型对照HEK293T细胞的线粒体胆碱转运，发现SNP-KI线粒体对胆碱的摄取明显减弱，这与SLC25A48-KO线粒体的变化相当(图4E)。此外，在基础和最大刺激条件下，SNP-KI线粒体产生的H₂O₂水平显著高于野生型细胞(图4F)。此外，脂质组学分析确定了类似SLC25A48-KO BAT线粒体的脂质种类的变化。SNP-KI细胞中Hex1Cer(d18:1/d18:0)的水平明显高于野生型对照细胞(图4G)。这些数据表明，携带SLC25A48 SNP rs200164783(A>G)的细胞表现出线粒体胆碱摄取减少、线粒体H₂O₂产量增加和HexlCer积累等与SLC25A48-KO细胞相似的变化。

上述结果促使研究人员进一步探究了SLC25A48 SNP rs200164783 (A>G)对细胞生长的影响。研究人员在含有生理浓度(28.5 mM)胆碱的全生长培养基中对SNP-KI和野生型对照细胞进行了细胞生长试验。与野生型对照相比，SNP-KI细胞生长显著降低(图4H)，而胆碱耗竭减弱了野生型对照细胞的细胞生长。此外，SNP-KI细胞的EdU掺入率显著低于对照细胞(图4I)。这些结果与SLC25A48缺失显著减弱细胞增殖的结果一致，而SLC25A48在KO细胞中的异位表达足以挽救细胞生长(图S4E)。

鉴于从头嘌呤核苷酸合成在癌症中的关键作用，研究人员接下来探究了SLC25A48介导的细胞增殖变化是否会扩展到癌细胞。研究人员使用四种独立的人类癌细胞，卵巢癌细胞(SKOV3)，胰腺癌细胞(PA-TU-8988T)和非小细胞肺癌细胞系(A549和H1299)表达SLC25A48。在所有被测癌细胞中，CRISPR-Cas9系介导的SLC25A48基因缺失导致细胞活力显著降低(图4J、图S4F)。在诱导SLC25A48缺失24 h内，超过50%的卵巢癌和肺癌细胞死亡，20%的胰腺癌细胞死亡。与SNP-KI细胞中的发现一致，缺乏SLC25A48的卵巢癌细胞未能启动G1到S期的相变(图4K)。同样，在U2OS骨肉瘤细胞中，SLC25A48的缺失也会损害细胞周期从G1到S期的转变(图S4G)。最后研究人员还探究了外源性甜菜碱挽救SLC25A48功能缺失引起的细胞变化，通过使用线粒体ROS指示剂MitoSOX，在标准生长培养基或添加10 mM甜菜碱的培养基中培养野生型对照和SNP-KI细胞，以评估线粒体ROS。在基础条件下，SNP-KI细胞的线粒体ROS水平明显高于对照细胞。在补充甜菜碱6小时后，SNP-KI细胞中的线粒体ROS信号显著降低至对照细胞中的同等水平(图4L)。然而，补充甜菜碱不足以恢复SNP-KI细胞的生长(图S4H)。这些数据表明，在SLC25A48缺失的细胞中，除线粒体甜菜碱合成外，还有其他途径抑制细胞生长。

图4.线粒体胆碱分解代谢通过SLC25A48调节细胞生长

图S4.SLC25A48-KI细胞和SLC25A48-KO细胞的分析

总结

在本研究中，研究人员发现SLC25A48是一种以前未被表征的线粒体内膜载体蛋白，控制线粒体胆碱运输和胆碱衍生甲基供体的合成,并且SLC25A48是棕色脂肪产热、线粒体呼吸和线粒体膜完整性所必需的。SLC25A48摄取胆碱进入线粒体基质促进了甜菜碱和嘌呤核苷酸的合成，而SLC25A48的缺失导致线粒体活性氧的产生增加和线粒体脂质失衡。携带SLC25A48基因单核苷酸多态性的人类细胞和缺乏SLC25A48基因的癌细胞表现出线粒体胆碱输入减少、氧化应激增加和细胞增殖受损。总之，本研究表明SLC25A48能够调节线粒体胆碱代谢和细胞活力。

文章链接:https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(24)00281-X