O连接N乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）糖基化细胞内是一种重要的动态且可逆的蛋白质翻译后修饰，涉及在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上添加单个N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）单元。这种修饰在多种细胞过程中起着关键作用，包括基因表达、信号传导、细胞周期和代谢。然而，关于 O-GlcNAc 调控机制的系统和多组学研究还较少。

大连理工大学在《Nature Communications》期刊发布题为"Proteomic profiling and genome-wide mapping of O-GlcNAc chromatin-associated proteins reveal an O-GlcNAc-regulated genotoxic stress response"的文章，通过蛋白质组学分析报道了O-GlcNAc糖基化在乳腺癌肿瘤细胞基因毒性应激（阿霉素）反应机制中的作用。

研究背景

基因毒性应激，如由化疗药物阿霉素（adriamycin）引起的DNA损伤，会激活细胞的应激反应程序，这些程序对于维持细胞稳态和生存至关重要。O-GlcNAc修饰与多种细胞内信号传导和基因表达调控有关，它在细胞应激反应中的作用尤为重要。O-GlcNAc修饰影响转录因子和辅因子的功能，从而可能调节基因的表达。这种修饰可以改变蛋白质的稳定性、转录活性、核定位以及蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA的相互作用。O-GlcNAc水平对细胞外信号和刺激（如葡萄糖浓度、激素和细胞应激）做出响应，表明它在细胞应激反应中可能发挥调节作用。了解O-GlcNAc修饰如何调节基因表达和细胞应激反应对于开发新的治疗策略，特别是在癌症治疗中，具有重要意义。为了系统地研究O-GlcNAc修饰的机制，研究人员采用了糖基化蛋白质组学和全基因图谱等方法揭示O-GlcNAc在基因毒性应激反应中的全局调控作用。

技术手段

实验材料：人类乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231实验方法：蛋白质组学、ChIP、RNA-seq

主要结果

OCP偏向转录参与应激反应

与亲代乳腺癌细胞MCF-7相比，阿霉素耐受的乳腺癌细胞MCF-7/ADR的染色质O-GlcNAc修饰显著上调，提示这种糖基化对基因毒应激反应的转录重编程存在调控作用。通过 LC-MS/MS 分析了 MCF-7 细胞中的 OCP。共鉴定出 990 个叠氮化物标记的 O-GlcNAc （O-GlcNAz） 蛋白。为了进一步减少在用于 O-GlcNAz 蛋白捕获的过程中非特异性相互作用引起的污染的影响，仅将位于细胞核中的候选蛋白视为OCP。对 575 个过滤的 OCP 进行GO分析显示与 RNA 剪接和核糖体调节相关通路的富集，这与以前已知的功能一致，此外还有细胞应激反应、转录调控和染色质重塑。这些结果表明即使在没有应激条件下，O-GlcNAc 相关的转录调控也可能干扰癌细胞应激反应。为了进一步验证这一假设，对已鉴定的 MCF-7 OCP 中与 166 个 OCTF 相关的推定功能过程进行了注释，并做PPI预测分析，结果显示细胞应激反应组与染色质重塑和转录调控组共享节点，这表明 OCTF 与应激反应基因转录有关，进一步的测定证实，多个 OCTF 和应激反应性基因启动子区域在 O-GlcNAz 染色质沉淀物中富集，这些结果表明，OCTFs 可能通过基因转录参与细胞应激反应。

图1 OCPs 与应激反应和转录调控有关。a.一种基于化学报告基因的代谢标记方法，用于通过免疫印迹和 LC-MS/MS 分析 OCPs。b.GalNAz 标记的 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞裂解物和染色质的免疫印迹和银染。C.MCF-7 细胞中 OCP 富集的 GO 分析。d.MCF-7 细胞中 OCTF 的 STRING PPI 分析和功能富集分析。

基因毒性应激诱导的 O-GlcNAc 增强了 OCPs 与染色质的全基因组相互作用

为了深入探索O-GlcNAc的细胞应激传感器功能，开发了一种遗传毒性适应的细胞模型。亲本 MCF-7 细胞在 8 个月的时间内暴露于浓度逐步增加的遗传毒性应激诱导剂 Adm 3132 中。Adm 抗性变体 （MCF-7/ADR， ADR）与亲本 MCF-7 细胞相比的 IC50 增加了 ~30 倍 ，ADR 细胞在全细胞裂解物和染色质结合的 O-GlcNAc 中表现出显着增加。在其他遗传毒性适应的细胞模型中也发现了类似的趋势， 通过 RNA-seq 进行基因表达谱分析确定了 ADR 和 MCF-7 细胞之间的 7112 个差异表达基因 （DEGs、错误发现率 （FDR） ≤ 0.001 和倍数变化 ≥ 2）。基因集富集分析 （GSEA） 显示，ADR 细胞表达参与细胞应激和 DNA 损伤反应的基因水平高于 MCF-7 细胞，这表明癌细胞通过染色质 O-GlcNAc 波动和许多基因的转录调控来适应遗传毒性应激。

为了对上述细胞模型中 O-GlcNAc 调控的基因进行全基因组评估，作者设计了一种整合组学策略，该策略结合了三个全球数据集：基于化学报告基因的 OCP 定量蛋白质组学、化学选择性 O-GlcNAc 染色质基因座（化学选择性O-GlcNAc染色质测序，COGC-seq）和 O-GlcNAc 调控的转录组学。对蛋白质组学数据集中的差异定量 OCP 和来自 COGC-seq 数据集的丰富 TF 基序进行综合分析，使我们能够识别遗传毒性应激诱导的 OCTF。此外，差异表达的 COGC-seq 峰相关基因与遗传毒性诱导的转录组相匹配。经过系统研究，出现了 O-GlcNAc 调控基因表达的全基因组机制。

图2 遗传毒性应激影响细胞模型中 OCP 的全基因组多组学分析. a.GalNAz 标记的 MCF-7 和 ADR 细胞裂解物和染色质的免疫印迹和银染. b.散点图显示了 MCF-7 与 ADR 细胞中 RNA-seq DEG 表达水平. c. MCF-7 细胞中 RNA-seq DEGs 与 ADR 细胞的 GSEA 比较。d.涉及基于全基因组化学报告基因的方法的多组学策略示意图。e. MCF-7 和 ADR 细胞中 OCP 的无标记相对定量蛋白质组学数据的火山图. f.整个人类基因组上COGC-seq峰位置的覆盖图。g.COGC-seq信号在峰值中心和TSSs((±3kb))处的密度热图,平均信号轮廓如图所示,红色表示低信号，蓝色表示高信号。

MCF-7 和 ADR O-GlcNAz 染色质的 9 个生物学重复之间的定量蛋白质组学比较表现出高度相关性，总共确定了1952种蛋白质。经过滤后还有1403种蛋白质，作者继续 1403 种蛋白质进行进一步分析。随后的统计分析显示，875 个 OCPs（458 个在细胞核中注释），包括 88 个 TFs 和辅因子，表现出 ≥2 倍的差异（p 值≤ 0.05，FDR ≤ 0.05）。大多数 OCPs 在遗传毒性适应后增加了与染色质的相互作用。在没有 O-GlcNAz 富集的情况下，绝大多数 OCP 数量无法反映转录组和全细胞蛋白质组学中的基因表达差异，这表明了这种基于化学报告基因的富集的特异性。相应地，GSEA 和 GO 分析表明，OCPs 主要参与细胞应激反应和其他遗传毒性应激相关过程（DNA 修复、细胞周期和细胞凋亡）。在 MCF-7 和 ADR 细胞之间观察到整体和染色质相关 OGT 的不可见变化，表明遗传毒性应激诱导的染色质 O-GlcNAc 波动与 OGT 表达无关。

随后，作者还做了O-GlcNAc 如何影响靶基因表达等研究，并观察到在遗传毒性应激反应期间，COGC-seq 信号从启动子和内含子/基因间平衡分布 （MCF-7） 转变为启动子偏向分布等等。

研究结论

总的来说，文章通过蛋白质组学等多组学联合分析，发现O-GlcNAc修饰在基因毒性应激下对蛋白质组产生了广泛影响，突出了O-GlcNAc修饰在细胞应激反应中的复杂作用。还构建了一个全面的转录重编程网络，揭示了O-GlcNAc修饰在基因毒性应激下的调控作用，这对于理解癌细胞如何适应和响应基因毒性应激具有重要意义。这些发现为开发新的癌症治疗策略提供了潜在靶点。