肉类是蛋白质、脂肪、维生素和微量元素的重要来源，其风味主要在热加工过程中产生，尤其是美拉德反应（Maillard reaction）在其中起着关键作用。美拉德反应产生肉制品吸引人的色泽和风味，同时对蛋白质的功能性质如溶解性、乳化性、凝胶性质和益生作用有所提升。调节蛋白质的糖化过程对学术界和食品工业都具有重要意义。

南京农业大学在《Food Chemistry》期刊发布题为"Proteomics analysis of the influence of proteolysis on the subsequent glycation of myofibrillar protein"的文章，通过蛋白质组学分析了蛋白质水解对肌原纤维蛋白后续糖基化影响。

研究背景

蛋白质组学用于研究蛋白质水解对肌原纤维蛋白糖基化的影响。木瓜蛋白酶和蛋白酶K分别产生最高水平的氨基酸(AAs)和肽。蛋白质组学分析显示，木瓜蛋白酶和蛋白酶k的蛋白水解提高了糖基化程度(A值从0.173提高到0.202-0.348)和速度(k值从0.0099提高到0.0132-0.0145)，极大地提高了赖氨酸、精氨酸和n端残基的糖基化位点数量。肌球蛋白轻链中Leu、Gly、Thr、Ala、Met、Ile、Phe和Val残基的糖基化位点数量增加。木瓜蛋白酶的蛋白质水解优先作用于肌动蛋白，因此特异性地增加了肌动蛋白的糖基化位点。蛋白质水解降低了醛类化合物的水平，但增强了芳香电子鼻信号，这可能是由于醛类化合物与释放的AAs/肽结合所致。蛋白质组学分析有助于详细描述蛋白质水解与随后糖基化/风味形成之间的关系。

技术手段

实验材料：3头20-24月龄的牛屠宰后24h的牛背最长肌，木瓜蛋白酶(Pap, 400单位/mg)、蛋白酶K (Pro K, 400单位/mg)和菠萝蛋白酶(Bro, 500单位/mg)实验方法：糖基化蛋白质组学、肽组学

主要结果

Pro K和Pap的蛋白水解分别产生高水平的肽和游离氨基酸

蛋白酶的作用导致肽键的水解，从而产生游离的氨基酸和肽。内肽酶的作用主要是产生多肽，而外肽酶的作用主要是产生游离氨基酸。随着处理时间的延长，肽键逐渐被水解，这可以从OPA法在340 nm处的吸光度升高中得到证明。经肽组学鉴定，蛋白酶K（Pro K）处理产生的肽段数量最多，达到1632种，其次是木瓜蛋白酶（Pap）处理的950种，菠萝蛋白酶（Bro）处理的762种，对照组只有163种。此外，鉴定了肽段的蛋白质来源。如，Pap处理的样品中，肽段主要来源于肌动蛋白、肌球蛋白-1、LIM结构域结合蛋白3、肌球蛋白轻链1和α-3肌动蛋白；而Pro K处理的样品中，肽段主要来源于肌球蛋白-1、肌球蛋白-2、肌球蛋白-7、肌球蛋白-4和肌动蛋白。木瓜蛋白酶似乎广泛作用于赖氨酸、丙氨酸、亮氨酸和天冬酰胺残基；蛋白酶K似乎更倾向于作用于赖氨酸、亮氨酸和天冬酰胺残基；而菠萝蛋白酶则更倾向于作用于甘氨酸残基。蛋白水解产生的新肽段和释放的额外N-末端氨基基团对糖化有贡献。如木瓜蛋白酶处理增加了N-末端位点的糖化，包括亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸残基。总之结果表明蛋白水解在很大程度上增强了肌原纤维蛋白的分散性。这可能会破坏肌纤维蛋白的自然结构，增加糖基化位点(赖氨酸和精氨酸)的可用性，因为蛋白质内部一些隐藏的赖氨酸/精氨酸残基可能会暴露出来，并在糖基化过程中更具活性。

图1 肌原纤维蛋白在蛋白水解过程中游离氨基的释放(A)、粒径的变化(B)以及游离氨基酸(C)和肽(D、E、F和G)的生成。D、E和F分别表示木瓜蛋白酶、蛋白酶K和菠萝蛋白酶处理1 h后多肽的释放情况。G表示经木瓜蛋白酶、蛋白酶K和菠萝蛋白酶水解1小时后，肌球蛋白轻链1产生的肽。

蛋白质水解诱导MPs糖基化的变化

通过蛋白组学分析发现蛋白水解通过增加肌纤维蛋白（MPs）的糖化位点数量，可以显著提高糖化程度，如通过Pap酶和Pro K酶的处理，A值从0.173增加到0.202-0.348和速度（k值从0.0099增加到0.0132-0.0145）。蛋白水解显著增加了赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）和N-末端残基的糖基化位点数量，如蛋白酶K处理1小时后，Lys残基的糖基化位点数量从75增加到190，Arg残基的糖基化位点数量也有所增加。还发现肌球蛋白轻链1和肌动蛋白等特定蛋白质上的糖基化位点，如肌球蛋白轻链1中的某些特定残基（如Leu, Gly, Thr, Ala, Met, Ile, Phe, Val）在蛋白水解后成为糖基化位点，其糖基化位点数量在蛋白水解处理后有所增加，这可能与这些蛋白质在肌肉结构中的功能和它们在蛋白水解过程中的易感性有关。鉴定到的糖基化修饰类型有葡萄糖化（Glucosylation）、羧甲基化（Carboxymethylation）、羧乙基化（Carboxyethylation）、吡啶啉（Pyrraline）、G-H1（Glyoxal-derived hydroimidazolone）、MG-H1（Methylglyoxal-derived hydroimidazolone）等，此外还发现随着糖化时间的延长，糖基化位点的数量和类型都有所变化，这表明蛋白水解不仅影响了糖化反应的初始阶段，还影响了随后的糖化过程。

图2 木瓜蛋白酶(A)、蛋白酶K (B)和菠萝蛋白酶(C)处理15和60 min诱导的肌原纤维蛋白糖化过程中氨基相对含量降低。实线为用originpro8.0拟合的相关单指数曲线。

图3 木瓜蛋白酶、蛋白酶K或菠萝蛋白酶水解1小时后糖基化0.5 h和2 h后化学修饰位点的变化。A表示糖化0.5 h后化学修饰位点的Venn图比较，B表示糖化2h后化学修饰位点的维恩图比较。C和D说明了蛋白水解诱导的糖基化2小时后肌球蛋白轻链1和肌动蛋白化学修饰位点的详细变化。E表示糖基化位点的蛋白来源;只有具有超过4个已鉴定的糖基化位点的蛋白质被单独说明。

在蛋白酶处理组中，醛类化合物减少，与芳香化合物相关的电子鼻信号增强

美拉德反应是肉类热处理过程中风味形成的重要因素。经GC-IMS分析，在没有添加葡萄糖的情况下，研究人员鉴定了36种挥发性化合物。蛋白水解处理的样品（尤其是经木瓜蛋白酶和蛋白酶K处理的样品）相比于对照组，大多数醛类化合物的含量降低。在添加葡萄糖后，鉴定出的挥发性化合物增加到53种，这表明美拉德反应对风味化合物的发展有显著贡献。经木瓜蛋白酶和蛋白酶K处理的样品中，多种醛类化合物的水平仍然较低，这可能与在蛋白水解过程中释放的氨基酸和肽段与醛类化合物进一步发生美拉德反应有关。经E-nose分析，与对照样品相比，经蛋白酶处理的样品在电子鼻分析中与芳香族化合物相关的传感器信号得到增强，而与甲烷、酒精、硫氯化合物相关的传感器信号则显著降低。电子鼻分析显示，蛋白水解显著降低了醛类化合物的水平，但增强了与芳香化合物相关的电子鼻信号，这可能与醛类化合物与释放的氨基酸/肽段结合有关。这些结果表明，蛋白水解通过改变肌纤维蛋白的结构，增加了游离氨基酸和肽段的数量，从而影响了美拉德反应过程中挥发性化合物的形成。特别是，蛋白水解增加了与芳香化合物相关的风味化合物的生成，这可能对肉类产品的风味特性有重要影响。

图4 通过GC-IMS和电子鼻鉴定，蛋白质水解(15min和60min)对MPs糖基化过程中挥发性化合物和气味分布的影响。A和B分别表示在有葡萄糖和无葡萄糖的条件下加热2小时，在15和60分钟的蛋白质水解处理下的挥发性曲线。C和D表示糖基化0.5 h后样品的气味分布; E和F表示糖基化2小时后的样品。CM和CMG分别代表无葡萄糖加热和有葡萄糖加热的MPs;MP和MPG代表木瓜蛋白酶处理的MPs加热无葡萄糖和有葡萄糖。MK和MKG分别代表蛋白酶k处理的MPs，分别在无葡萄糖和有葡萄糖的情况下加热;MB和MBG分别代表经菠萝蛋白酶处理的MPs，不加葡萄糖加热或加葡萄糖加热。数字15和60分别表示酶处理时间为15和60 min。小写字母(a-e)表示相同处理下不同酶处理组之间的显著性水平不同。

研究结论

总的来说，文章通过蛋白质组学分析，发现蛋白水解通过增加肌纤维蛋白（MPs）的糖化位点数量，显著提高了糖化程度和速度。这主要是通过暴露更多的赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）残基以及生成新的N-末端糖化目标来实现的。此外还发现蛋白水解通过降低醛类化合物的水平，但增强了与芳香化合物相关的风味化合物的信号，从而影响了肉类风味的形成。这可能是由于释放的氨基酸和肽段与醛类化合物结合，进一步参与美拉德反应。蛋白水解和糖化之间存在复杂的相互作用，这些相互作用对肉类风味化合物的形成具有重要影响。这些发现为食品工业提供了潜在的应用策略，如通过控制蛋白水解的程度和条件来调节肉类产品的风味特性等。