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一、产品简介:
氧化型谷胱甘肽(GSSG)是谷胱甘肽(GSH)的氧化形式,又称为二硫代谷胱甘肽,是两分子的谷胱甘肽氧化而成。还原型与氧化型比值(GSH/GSSG)是细胞氧化还原状态的主要动态指标。因此,测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值,能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。
本试剂盒利用谷胱甘肽能和DTNB反应产生的2-硝基-5-巯基苯甲酸在波长 412nm 处具有最大光吸收的特点,通过 2-乙烯吡啶抑制样本中原有的还原型谷胱甘肽,然后利用谷胱甘肽还原酶将 GSSG 还原为 GSH,还原型谷胱甘肽GSH与DTNB与反应生成复合物,在412nm处有特征吸收峰;其吸光度与GSH含量成正比。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体550μL×1支 | -20℃保存 | |
试剂二 | 液体15mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体1.1mL×2支 | 4℃保存 | |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 | 临用前加入2.5mL提取液,充分溶解后备用(配制后-20℃分装保存,避免反复冻融) |
试剂五 | 液体550μL×1支 | 4℃避光保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL蒸馏水,充分溶解。(即10mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、超声细胞破碎仪、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g样本,加入 1mL提取液,进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清液放置于冰上待测。若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存3天)。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存3天)。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(106):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 血液处理
血浆:将收集的抗凝血于600g,4℃离心10min,吸取上层血浆到另一支试管中,加入等体积的提取液,4℃, 8000g 离心 10 分钟,将上清移入新的试管中放置于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存3天)。
血细胞:将收集的抗凝血于 600g,4℃离心10min,弃去上层血浆用3倍体积的PBS清洗 3次(用PBS重悬血细胞,600g离心10分钟),加入等体积的提取液,混匀后4℃放置10分钟,8000g离心10分钟,吸取上清放于4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 3 天)。
2、标准溶液的配制:把10mg/mL(即10000μg/mL)标准品母液用蒸馏水稀释成120,60,30,15,7.5,3.75μg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(μg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (μg/mL) |
Sx | 10000 | 450 | 50 | 1000 |
S1 | 1000 | 440 | 60 | 120 |
S2 | 120 | 200 | 200 | 60 |
S3 | 60 | 200 | 200 | 30 |
S4 | 30 | 200 | 200 | 15 |
S5 | 15 | 200 | 200 | 7.5 |
S6 | 7.5 | 200 | 200 | 3.75 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm。
② 操作表:
测定管 | 标准管 | 空白管 | |
样本 | 20 | - | - |
标准溶液 | - | 20 | - |
蒸馏水 | - | - | 20 |
试剂一 | 5 | 5 | 5 |
37℃ 孵育 30 分钟后,继续加入下列试剂 | |||
试剂二 | 130 | 130 | 130 |
试剂三 | 20 | 20 | 20 |
试剂四 | 20 | 20 | 20 |
试剂五 | 5 | 5 | 5 |
加入试剂五的同时开始计时,迅速混匀,测定 412nm 处 30s 和 150s 吸光值 A1测定(A1标准、A1空白)和 A2测定(A2标准、A2空白),计算 ΔA测定=A2测定 - A1测定,ΔA标准=A2标准 - A1标准,ΔA空白=A2空白 - A1空白。(注:空白管和标准曲线只需做 1-2 次) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的(ΔA标准-ΔA空白)为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将(ΔA测定-ΔA空白)带入方程得到x(μg/mL)。
2、按蛋白浓度计算:
GSSG含量(μg/mg prot)=x×V1÷(V1×Cpr)×D=x÷Cpr×D
3、按样本质量计算:
GSSG含量(μg/g 质量)=x×V1÷(V1÷V×W)×D=x÷W×D
4、按细胞数量计算:
GSSG含量(μg/104 cell)=x×V1÷(V1÷V×N)×D=x÷N×D
5、按液体体积计算:
GSSG(μg/mL)=2x×D
V:上清液总体积,1.0mL; V1:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02 mL;
W:样品质量,g; N:细胞数量:以万计;
Cpr:蛋白质浓度,mg/mL; 2:血浆(血细胞)稀释一倍;
D:稀释倍数,未稀释即为1。
注意事项:
①样本处理需匀浆完全,若当天不能完成测量,可放-80℃保存。
②若不确定样本中 GSSG 含量的高低,可稀释几个梯度后再进行测量。
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