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一、产品简介:
抗坏血酸即维生素C,它是一种高活性物质,参与很多新陈代谢活动。抗坏血酸是生物体内抗氧化体系成员之一,因此抗坏血酸含量可作为植物抗衰老和抗逆境的重要生理指标。 还原型抗坏血酸(ASA)可以把铁离子还原成亚铁离子,亚铁离子与红菲咯琳(BP)反应形成红色螯合物。此物质在534nm波长的吸收值与ASA含量呈正相关,故可用比色法测定。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体80mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
试剂一 | 自备 | 4℃保存 | 无水乙醇 |
试剂二 | 液体5.5mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 | 使用前加入6mL无水乙醇充分溶解 (可超声溶解) |
试剂四 | 液体3mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加1mL提取液充分溶解,现用现配。(即10mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、无水乙醇、冰和蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。 4000rpm,4℃离心 10min ,取上清置于冰上待测。
② 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后,取上清置于冰上待测。
2、标准溶液的配制:把10mg/mL 的标准品母液用提取液稀释成10 μg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
S1 | 10 | 900 | 100 | 1 |
S2 | 1 | 900 | 100 | 0.1 |
S3 | 0.1 | 900 | 100 | 0.01 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至534nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 200 | 200 | - | - |
标准溶液 | - | - | 200 | - |
提取液 | - | - | - | 200 |
试剂一 | 100 | 250 | 100 | 100 |
充分混匀 | ||||
试剂二 | 50 | 50 | 50 | 50 |
试剂三 | 100 | - | 100 | 100 |
试剂四 | 50 | - | 50 | 50 |
混匀,30℃水浴60min后,取200μL反应液至96孔板中,测定534nm处各管吸光值A,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。计算ΔA测定=A 测定-A 对照,ΔA标准=A 标准-A空白。(注:每个测定管需要一个对照管,空白管只需测定1-2次。) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值大于1.0,可用提取液对样本进行稀释。则稀释倍数D需代入公式重新计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、按样本质量计算:
AsA(μg/g 质量) =(C标准×V1×ΔA测定÷ΔA标准)÷(W×V1÷V) ×D
=10×ΔA测定÷ΔA标准÷W×D
2、按液体体积计算:
AsA (μg/mL) =(C标准液×ΔA测定÷ΔA标准×V1)÷V1×D
=10×ΔA测定÷ΔA标准×D
C标准:标准液浓度,10μg/mL; V1:加入反应体系中上清液体积,0.2 mL;
V:加入提取液的体积,1.0mL; W:样品质量(g);
D:稀释倍数,未稀释即为1。
注意事项:
标准品现用现配,若溶液变黄,则不能使用。
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GMT+8, 2024-9-27 10:35
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