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一、产品简介:
生物碱存在于自然界(主要为植物,但有的也存在于动物)中的一类含氮的碱性有机化合物,大多数有复杂的环状结构,氮素多包含在环内,有显著的生物活性,是中草药中重要的有效成分之一。 生物碱与溴甲酚绿指示剂反应,生成绿色化合物,在 416nm 处有最大吸收峰。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体110mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体28mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体12mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 液体2mL×1支 | 4℃保存 | 1mg/mL标准品母液 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、超声波清洗器、恒温水浴锅/培养箱、研钵、天平、可调式移液器、40-60目筛、三氯甲烷、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备:
样本烘干粉碎,过 40-60目筛。称取约 0.02g 样本,加入 1mL提取液,充分混匀后,超声提取 60min。8000 g,25℃离心 10 min,取上清液待测。
2、标准溶液的配制:把1mg/mL标准品母液用提取液稀释成0.3、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 mg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
S1 | 1 | 350 | 150 | 0.3 |
S2 | 1 | 800 | 200 | 0.2 |
S3 | 0.2 | 500 | 500 | 0.1 |
S4 | 0.1 | 500 | 500 | 0.05 |
S5 | 0.05 | 500 | 500 | 0.025 |
S6 | 0.025 | 500 | 500 | 0.0125 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至416nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 50 | - | - |
标准溶液 | - | 50 | - |
提取液 | - | - | 50 |
试剂一 | 250 | 250 | 250 |
试剂二 | 100 | 100 | 100 |
混匀,室温静置 5min | |||
三氯甲烷 | 500 | 500 | 500 |
剧烈振荡混匀,室温静置 40min,吸取下层氯仿层 200µL 于 96 孔板,静置5min,待反应液澄清后读取416nm 处吸光值A,分别记为A测定、A标准、A空白。计算ΔA测定=A 测定-A 空白,ΔA标准=A 标准-A 空白。(注:空白管只需测定1-2次。) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。
2、按照样本质量计算:
总生物碱含量(mg/g 质量)=x×V÷W×D=x÷W×D
V:提取液的总体积,1mL; W:样品质量,g;
D:稀释倍数,未稀释即为1。
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GMT+8, 2024-10-19 23:05
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