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      水凝胶（如明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）、透明质酸甲基丙烯酸酯（HAMA）、壳聚糖）作为微针的基材已经引起广泛关注，因为它们具有优异的生物相容性和药物负载能力，可用于输送各种药物，包括小分子、生长因子和细胞外囊泡。尽管这些水活性小分子或大分子的封装能力得到了发现，但水凝胶的固有性质，即其松散的分子网络，导致其快速降解速率，并最终导致封装药物的突发释放（约3天），使其在慢性伤口的治疗过程中（通常需要几周甚至几个月）作为传递载体的功能受到了限制。因此，学者们开发了微针材料，其中包括聚乳酸-聚乙二醇酸（PLGA）、聚己内酯（PCL）、聚苯乙烯和聚乙二醇酸等更密集和更坚硬的聚合物，以实现持续药物释放。然而，这些材料无法有效地加载生物活性大分子，因为它们的制备和药物加载条件严苛，涉及高温、有机溶剂以及可能破坏大分子的生物活性的因素。传统上，用于皮肤再生的微针受到无法控制的多药物释放、有限类型的药物和伤口粘附不良的限制。

来自来自香港理工大学的赵昕团队、浙江大学的贺永团队与苏州大学的李斌团队合作开发了一种新型的核壳微针贴片，用于无痕皮肤修复，其中壳层由负载有抗炎小分子芒果苷的亲水性GelMA（EFL-GM-60）组成，而核心由负载有生物活性大分子和人间充质干细胞（hMSC）衍生外泌体的疏水性聚（乳酸-丙二醇-乳酸）二甲基丙烯酸酯（PGLADMA）组成。这种材料选择带来了几个优点：GelMA壳层提供了组织锁定的肿胀界面，并在早期伤口愈合阶段迅速释放芒果苷以进行抗炎；而PGLADMA核心提供了外泌体的长期封装和释放（3周内释放30%），促进持续的血管生成和抗炎作用。结果表明，核壳微针具有抗炎性能，并且可以在体外通过巨噬细胞极化和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的管形成，以及体内通过抗炎作用、上皮再生和血管形成诱导血管生成。重要的是，我们还观察到体内瘢痕形成减少。总的来说，亲水性/疏水性材料的降解动力学使得设计差异性和长期释放的核壳微针成为可能，促进无痕皮肤再生，并具有潜力用于其他长期外泌体释放治疗。相关工作以题为“Differential-targeting core-shell microneedle patch with coordinated and prolonged releases of mangiferin and MSC-derived exosomes for scarless skin regeneration”的文章发表在2024年04月11日的国际著名期刊《Materials Horizons》。

1. 创新型研究内容

本研究开发了一种核壳微针贴片，外壳使用GelMA，并负载芒果苷（一种抗炎的小分子药物），内核使用聚乳酸-丙二醇-乳酸二甲基丙烯酸酯（PGLADMA）并负载生物活性大分子人间充质干细胞（hMSC）衍生的外泌体（图1）。这种分层材料策略解决了药物负载与疗效之间的矛盾关系，同时保留了微针设计的优点：一方面，GelMA壳层迅速膨胀释放芒果苷，导致组织间的粘附和早期抗炎作用；另一方面，密集的PGLADMA聚合物可以通过低热发生快速光交联，实现高效的外泌体负载，并防止外泌体的快速扩散，实现持续释放和材料降解。这种持续释放外泌体的能力提升了其固有的有益特性，用于伤口愈合：通过M2极化的抗炎作用、系统性组织再生的改善以及血管生成和管形成的增强。在伤口愈合的后期增殖/重塑阶段，其持续释放还可以促进血管生成和细胞迁移。在这样的核壳设计和治疗选择下，GelMA和PGLADMA的差异性降解以及封装性能的协同作用，使得单个微针贴片可以协调处理不同的伤口愈合阶段。本研究相信，这种将亲水性水凝胶和疏水性聚合物耦合用于抗炎和长期外泌体释放的新型微针策略，不仅在实验中展示了作为一种有前景的皮肤伤口敷料的临床治疗，而且为构建下一代多功能微针提供了通用的策略，用于各种组织再生。

图1 结构示意图

【核壳微针贴片的制备和表征】

对于所提出的核壳微针系统（图2A），使用PGLADMA作为微针的核心（内层）材料，GelMA作为外壳（外层）材料。如前文所述，这实现了PGLADMA内层用于缓慢释放外泌体，以及具有突发释放特性的粘附性GelMA外层。本研究利用负微针模具进行制备，包括四个步骤：通过真空和光交联使GelMA在模具中凝固（图2Ai），将GelMA风干形成外层结构（图2Aii），通过真空和光交联使PGLADMA包埋在GelMA中（图2Aiii），最后脱模得到微针产品（图2Aiv）。首先表征了制备的核壳微针贴片的结构。图2B、2C和2D显示了完整微针的宏观图像、显微镜下微针的GelMA部分和显微镜下的完整微针（带有P₇L₂DMA），分别测量了每根单针的平均针长为403±12μm，基底直径为270±0.40μm。为可视化微针的内部结构，分别用红色和蓝色染色GelMA和P₇L₂DMA层。如图2Ei-iii所示，GelMA和P₇L₂DMA具有明显的核壳结构。然后，用扫描电子显微镜（SEM）检查了GelMA和P₇L₂DMA之间的临时界面。如图2F所示，外层（GelMA）和内层（P₇L₂DMA）呈现出不同的形态，GelMA层更粗糙多孔，而P₇L₂DMA层更均匀。本研究认为，GelMA层的不规则性便于在以下两个方面与P₇L₂DMA进行整合和结合。首先，这使得P₇L₂DMA前体在真空步骤中渗入GelMA壳层中（图2A），使得两层在交联步骤中相互锁定。其次，在脱模后，由于残留水分的蒸发，GelMA壳层会继续收缩，从而紧密包裹P₇L₂DMA材料。还通过使用共聚焦显微镜在不同高度（从50μm到200μm）上捕捉染色的单根针尖来表征z-级别的材料分布（图S1）。GelMA壳层（红色）在P₇L₂DMA核心（蓝色）周围呈完美的圆形分布：随着切面高度的增加并接近针尖，核心和壳层的直径减小。

图2 制备、形态、结构和核壳微针贴片的肿胀情况

【核壳微针贴片的机械和组织粘附性能】

由于所提出的微针系统用于插入皮肤伤口（众所周知，皮肤伤口比角质层更柔软且弹性较小），如果针尖过于坚硬，很容易对伤口造成二次损伤。GelMA在其肿胀状态下足够柔软以进行组织穿透，并且其脱水可以增强其聚合物网络的包装效应，增加其刚度。因此，选择使用脱水的GelMA外壳来促进伤口的插入。插入后，GelMA首先吸收间质液体，肿胀，并在与伤口组织相互交错时变得更柔软，为周围组织提供适当的组织粘附力和生物相容性。图3A展示了具有上述特性的微针压缩设置。如图3B所示，所有组中的微针在类似位移（约280μm）处发生断裂，纯P₇L₂DMA微针、纯GelMA微针和核壳微针的平均断裂力分别为0.26 N/针、0.30 N/针和0.32 N/针（图3C）。此外，GelMA和核壳微针的断裂力没有显著差异，这表明GelMA是提供插入力和因此为微针提供组织相互锁定的主要组分。注意到上述断裂力实际上远远超出了穿透猪皮所需的力（约为0.05 N/针，并且表明足够的伤口插入），实际上这在图3D中得到了证明，其中显示了一系列红点。为进一步验证GelMA的动态组织相互锁定机制，本研究使用了一个包括以下三个步骤的设置：插入、稳定和对猪皮进行拉伸，图3E说明了我们的设置。首先，将微针插入猪皮2分钟，使其附着在皮肤表面。如图3G所示，在微针从猪皮上拉出之前（0 - 180秒），纯P₇L₂DMA和核壳组的曲线非常吻合，在插入过程中（0 - 60秒）快速增加到约0.20 N，并在稳定期（60 - 180秒）保持稳定的载荷值。然而，在拉伸过程中（180 - 200秒），核壳微针的载荷曲线中黏附力急剧上升，而纯P₇L₂DMA微针没有显著的黏附力。图3H也显示了核壳微针的平均黏附力为0.25 N，是纯P₇L₂DMA微针（0.02 N）的十倍。这种强大的相互锁定力归因于肿胀的GelMA壳层，如果没有P₇L₂DMA核心，纯GelMA微针在拉伸过程中会变得过于柔软并破裂。这表明本研究的核壳微针贴片具有足够的组织粘附力以进行长期药物输送。

图3 核壳微针贴片的机械性能

【核壳微针贴片的体外药物释放】

为了制备载药微针，将外泌体加载到P₇L₂DMA溶液中，将芒果苷加载到GelMA溶液中（图2Ai-iv）。药物封装对微针贴片的机械和组织粘附性能没有显著影响。本文发现，86.94 ± 2.25％的芒果苷在最初的8小时内迅速从GelMA中释放，累积百分比在48小时内达到93.84 ± 2.94％（图4A）。选择Weibull函数来拟合释放数据：Q(t) = Q_∞ (1 – exp (-at^b))，其中Q(t)是时间t释放的药物百分比，Q_∞ 是无限时间内释放的药物百分比，a是比例因子，b是形状因子。拟合曲线后，释放曲线可以用方程描述：Q(t) = 91.42 (1 – exp (-0.434t))，其中b等于1，表明芒果苷从GelMA中的释放符合费克扩散定律。这种快速的芒果苷释放符合抗炎的早期阶段需要，该阶段通常持续2-3天。

图4 核壳微针贴片中的药物释放情况

【核壳微针贴片的体外抗炎作用】

为研究微针中不同成分的抗炎作用，实验中使用了不同组的提取液，包括对照组、LPS组、P₇L₂DMA组、GelMA组、MN/MF组（100 μg/mL芒果苷载药微针）、MN/EXO组（1 mg/mL外泌体载药微针）和MN/MF/EXO组（100 μg/mL芒果苷和1 mg/mL外泌体载药微针）。所有提取液均添加了100 ng/mL的LPS，并用于处理巨噬细胞48小时。从图5A和5C的亮场图像可以看出，所有治疗组的巨噬细胞细胞面积均大于对照组，初步表明了表型转变。图5B显示了不同组CD86⁺细胞比例的定量分析结果，其中LPS组（88.95 ± 2.15%）的CD86⁺细胞比例显著高于对照组（4.99 ± 2.01%），证明LPS成功诱导了M1转变。GelMA组（87.33 ± 2.4%）和P₇L₂DMA组（87.56 ± 1.63%）的CD86水平与LPS组相似，说明对免疫调节没有明显影响。然而，MN/MF组（59.77 ± 4.68%）、MN/EXO组（56.97 ± 3.48%）和特别是MN/MF/EXO组（49.55 ± 5.06%）显著降低了CD86⁺细胞的比例，表明芒果苷和外泌体均能促进巨噬细胞的M1-M2转变。对于图5D，GelMA组（27.21 ± 4.74%）和P₇L₂DMA组（25.22 ± 4.24%）的CD206水平与LPS组（31.94 ± 8.36%）相似，说明对免疫调节没有明显影响，而MN/MF组（89 ± 2.04%）、MN/EXO组（93.13 ± 2.41%）和MN/MF/EXO组（93.53 ± 1.93%）显著增加了CD206⁺细胞的比例，与对照组（51.44 ± 8.63%）和LPS组相比，显示出良好的免疫调节效果。

图5 核壳微针中不同成分的免疫调节效应

【核壳微针贴片的体外血管生成和伤口愈合】

血管生成和细胞迁移能力在伤口愈合过程中也至关重要。针对这两个方面，本文研究了HUVECs的管状结构形成以及L929成纤维细胞和HUVECs的迁移能力（图6）。实验中使用了六组提取液，包括对照组、P₇L₂DMA组、GelMA组、MN/MF组、MN/EXO组和MN/MF/EXO组。将提取液与HUVECs共培养6小时，并首先观察了它们的管状结构形成。如图6A所示，MN/EXO组和MN/MF/EXO组在大部分区域都显示出明显的管状结构形成；而对于对照组、GelMA组和MN/MF组，只观察到少量短的细胞连接。对于定量测量，评估了总管长、连接点数和网状结构数（图6Ci-iii）。与观察结果一致，MN/EXO组和MN/MF/EXO组的这三个指标均显著高于其他组，表明外泌体在管状结构形成和血管生成中起着关键作用。对于细胞迁移，图6B显示了不同组在0小时、24小时和48小时的伤口闭合率，图6D显示了24小时闭合率的定量分析结果。类似地，对于成纤维细胞的细胞迁移实验，MN/EXO组和MN/MF/EXO组表现出加速的伤口闭合，平均闭合率分别为91.88 ± 2.34%和95.40 ± 1.18%；对照组、P₇L₂DMA组、GelMA组和MN/MF组的伤口闭合率分别为33.32 ± 4.21%、37.65 ± 2.27%、32.46 ± 6.82%和31.47 ± 1.89%，与MN/EXO组和MN/MF/EXO组相比没有显著差异。

图6 微针中不同成分的血管生成和体外伤口愈合效应

【核壳微针贴片的体内治疗效果】

通过组织学评估进一步分析了不同组的伤口愈合效果。图7A展示了不同组伤口组织在第7天和第14天的代表性H&E染色图像。使用低倍镜观察总体上的再上皮化、炎症和肉芽组织形态。图7B中还测量了定量的再上皮化比率。在第7天，MN/MF/EXO组（61.30 ± 3.51%）和MN/EXO组（53.00 ± 3.61%）的再上皮化明显高于其他组（空白组4.33 ± 0.58%；纯MN组6.00 ± 2.65%；MN/MF组13.33 ± 3.51%）；在第14天，MN/MF/EXO组（87.67 ± 7.10%）、MN/EXO组（86.33 ± 4.04%）和MN/MF组（56.33 ± 6.51%）的再上皮化显著高于其他组（空白组20.67 ± 3.06%；纯MN组25.33 ± 4.51%）。此外，MET长度，也代表着再上皮化能力，标记在第7天图像的放大视图中，并在图7C中进行定量分析。根据再上皮化数据，在所有组中，MN/MF/EXO组和MN/EXO组在第7天显示出较长的MET长度，而其他三组在第7天没有显著差异。这些结果证明了芒果苷和尤其是外泌体在创面中极大地促进了细胞迁移，从而加速了再上皮化。结果表明，芒果苷和外泌体极大地促进了皮肤伤口的闭合和再上皮化。

图7 使用H&E染色对伤口进行组织学评估

为阐明伤口愈合加速的潜在机制，使用CD31（血管生成标记物）、IL-10（抗炎标记物）和TNF-α（促炎标记物）免疫染色，在第7天的组织切片中检测早期炎症和血管生成的迹象。图8A展示了不同组CD31的代表性图像，图8B-C分析了血管数量和血管面积。与其他的体内结果类似，外泌体提供了出色的全身再生效应，使得MN/MF/EXO组在血管数量和血管面积方面与其他组相比最高，其次是MN/EXO组。其余组的CD31表达没有显著差异。对于抗炎作用，图8D展示了不同组IL-10和TNF-α的代表性图像，并在图8E-F中对平均荧光强度进行了定量分析。本研究发现，芒果苷和外泌体显著降低了TNF-α的表达并提高了IL-10的表达，表明存在抗炎反应。芒果苷和外泌体的联合治疗在抗炎作用上比单独治疗效果更强，表明当两种治疗方法结合时具有协同的长期抗炎效应。总之，核壳微针成功地展示了在体内抑制炎症和促进血管生成的能力。

图8 在第7天对不同组别进行体内血管生成和抗炎效应的评估

除了恢复抗炎和血管生成等调节过程外，无瘢痕皮肤伤口愈合也被视为再生皮肤功能恢复的另一个重要指标。本研究假设外泌体和芒果苷的联合可以抑制肌成纤维细胞的激活，调节基质沉积及其微环境，减少瘢痕形成。因此，本研究评估了不同组再生伤口在14天后的瘢痕形成情况。选择以下与瘢痕相关的蛋白进行免疫染色：α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），代表合成基质和负责伤口收缩和瘢痕形成的肌成纤维细胞；转化生长因子-β（TGF-β），代表基质沉积和伤口区域的相关应力环境；结缔组织生长因子（CTGF），是肌成纤维细胞激活、基质沉积和纤维化相关通路的关键介质，也是肥厚性瘢痕和疤痕疙瘩的关键标记物；以及胶原I型（Col I），是一般瘢痕的主要成分。图9展示了不同微针组的创面情况。如图9A所示，并在图9B-E中定量分析的结果显示，与其他组相比，MN/MF/EXO组在所有标记物中的表达显著降低，其次是MN/EXO组，然后是MN/MF组。所有这些结果表明，核壳微针贴片通过调节多个关键细胞因子，包括α-SMA、TGF-β和CTGF，能够显著减少瘢痕形成。特别是人间充质干细胞来源的外泌体在这个过程中起到了至关重要的作用，通过系统性改善和调节与瘢痕相关的细胞因子，而芒果苷主要影响α-SMA和TGF-β的表达，实现有效的抗炎作用。

图9 在第14天评估不同组别处理的伤口的体内瘢痕形成情况

2. 总结与展望

总之，本研究制备了一种PGLADMA/GelMA核壳微针贴片，其中壳层中负载了芒果苷，核心中负载了hMSC衍生外泌体，用于无痕皮肤伤口愈合。这种核壳结构的好处在于，GelMA壳层能够迅速释放芒果苷，用于早期的抗炎作用，而PGLADMA核心能够长时间释放外泌体，促进血管生成和细胞增殖。结果显示，这种差异性释放取得了成功，包括在体内对伤口部位的免疫调节效应，抑制了促炎细胞因子TNF-α和抗炎细胞因子IL-10，促进了体外HUVECs的细胞迁移和管形成，并在体内通过NF-κB信号通路的标志物（α-SMA、TGF-β、CTGF、Col I）实现了新生血管形成。总的来说，本研究的核壳微针不仅利用材料特性和微针设计实现了无痕皮肤再生策略，还首次展示了一种用于治疗目的的水凝胶策略，以实现外泌体的长期封装释放。这为未来的生物材料研究提供了重要的指导，充分利用外泌体治疗的长期益处，特别是使用水凝胶微针进行多阶段组织再生。然而，目前的研究仍存在一些限制。虽然14天的体内实验结果已经证明了核壳微针的抗瘢痕功效，但未来将进行更长时间（例如28天）的动物实验，以更好地展示减少瘢痕的效果。

文章来源：

https://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2024/MH/D3MH01910A