一、产品简介：

多种微生物、动物、植物等都可产生几丁质酶，高等植物本身不存在作为真菌细胞壁组分之一的几丁质，但当植物受到病原菌感染时，几丁质酶活性迅速提高。因此该酶与植物对病原微生物的抗性有关，是重要的病程相关蛋白。

  几丁质酶主要水解几丁质多聚体中的β-1,4-糖苷键，依据水解口位置的不同可分为内切几丁质酶和外切几丁质酶。几丁质酶催化几丁质水解形成的产物为N-乙酰葡萄糖胺（Glc-NAcc）单体，产物在580 nm处具有特征吸收峰，通过吸光值变化即可表征几丁质酶的活性。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、超声波破碎仪、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、超声清洗仪、可调式移液器、冰、蒸馏水。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。10000g，4℃离心 20min，取上清，置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞，加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；10000g，4℃离心 20min，取上清，置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积（mL)为500~1000:1比例进行提取。

③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。

2、标准溶液的配制：把10mmol/mL标准品母液用蒸馏水稀释成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 mmol/mL的标准溶液备用。

3、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min，调节波长至580nm。

② 操作表：

3、正式实验：

① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围：高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后或适当缩短 37℃水浴时间后再进行测定，低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定，并将改变后的T、D和W代入公式计算；

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行（标准管和空白管预实验已做，正式实验可选做）。

五、结果计算：

1、标准曲线的绘制：以ΔA标准为y轴，标准溶液浓度为x轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b。将ΔA测定带入标准方程中，得到x（mmol/mL）。

2、按照样本质量计算：

酶活性定义：37℃下，每g组织每小时分解几丁质产生1mmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位（U）。

几丁质酶活性（U/g 质量）=x×V2÷（V1÷V×W）÷T×D=0.67×x÷W×D

3、按照蛋白质浓度计算：

酶活性定义：37℃下，每mg蛋白每小时分解几丁质产生1mmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位（U）。

几丁质酶活性（U/mg prot）=x×V2÷（V1×Cpr）÷T ×D=0.67×x÷Cpr×D

4、按照细胞数量计算：

酶活性定义：37℃下，每10⁴个细胞每小时分解几丁质产生1mmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位（U）。

几丁质酶活性（U/10⁴cell）=x×V2÷（V1÷V×细胞数量）÷T×D =0.67×x÷细胞数量×D

5、按照样本体积计算：

酶活性定义：37℃下，每mL培养液每小时分解几丁质产生1mmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位（U）。

几丁质酶活性（U/mL）=x×V2÷V1÷T×D =0.67×x×D

V1：反应体系中样本体积，0.1mL；        V2：酶促反应总体积，0.2ml；

V：加入提取液体积，1mL；               W：样本质量，g；                      

T：反应时间，3h；                       细胞数量：以万计。

D：稀释倍数，未稀释即为1；             Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。