||
一、产品简介:
漆酶(CE1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,属于铜蓝氧化酶家族,漆酶存在菇、菌及植物中,是一种环保型酶,其独特的催化性质在生物检测中有广泛的应用。 漆酶分解底物ABTS产生ABTS自由基,在420nm处的吸光系数远大于底物ABTS,测定ABTS自由基的增加速率,可计算得漆酶活性。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体120mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体25mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂×2瓶 | 4℃避光保存 | |
工作液的配制:临用前,每瓶试剂二加入10 mL试剂一充分溶解,现用现配。建议尽快使用,4℃保存一周,若变色则不能使用。 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、超声波破碎仪、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、超声清洗仪、可调式移液器、冰、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆,于 4℃下孵育60min。10000g,4℃离心 10min,取上清,置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌或细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细菌或细胞,加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率300W,超声3s,间隔7s,总时间 3min);10000g,4℃离心 10min,取上清,置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min,调节波长至420nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管 |
样本 | 25 | - |
蒸馏水 | - | 25 |
工作液 | 175 | 175 |
充分混匀,于 420nm 处测定 10s 时的吸光值 A1,迅速置于 45℃水浴/恒温培养3min,拿出迅速擦干立即测定吸光值A2,计算ΔA测定= A2测定-A1测定,ΔA空白=A2空白-A1空白,ΔA=ΔA测定-ΔA空白。(注:空白管只需做1-2次) |
3、正式实验:
① 若测定吸光值超过0.9,请将样本用提取液进行适当的稀释再测定,并将改变后的D代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
①按蛋白浓度计算
酶活定义:每mg蛋白每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
漆酶酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V2×109÷(V1×Cpr)÷T×D=74.07×ΔA÷Cpr×D
②按样本质量计算
酶活定义:每g样本每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
漆酶酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V2×109÷(V1×W÷V)÷T×D=74.07×ΔA÷W×D
③按细胞数量计算
酶活定义:每 104 个细胞每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
漆酶酶活(U/104cell)=ΔA÷(ε×d)×V2×109÷(细胞数量×V1÷V)÷T×D
=74.07×ΔA÷细胞数量×D
④按液体体积计算
酶活定义:每 mL 液体每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
漆酶酶活(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V2×109÷V1÷T×D=74.07×ΔA×D
ε:ABTS 摩尔消光系数:3.6×104L/mol/cm; d:比色皿光径,1cm;
V2:反应总体积,2×10-4L; V1:反应中样本体积,0.025mL;
V:加入提取液体积,1mL; W,样本质量,g;
T:反应时间,3min; 细胞数量:以万计;
D:稀释倍数,未稀释即为1; 109:单位换算系数,1mol=109nmol。
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL。
Archiver|手机版|科学网 ( 京ICP备07017567号-12 )
GMT+8, 2024-8-7 08:25
Powered by ScienceNet.cn
Copyright © 2007- 中国科学报社