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一、产品简介:
β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)又称β-D-半乳糖苷半乳糖基转移酶,简称乳糖酶,专一性作用于β-D-半乳糖苷类化合物的酶,是细胞溶酶体中的水解酶,该酶广泛存在于各种动物、植物及微生物中,特别是哺乳动物肝、肾、脾及小肠等脏器中。 β-GAL 分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成邻-硝基苯酚,后者在 416nm 有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算 β-GAL 活性。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体2mL×2支 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体1.5mL×1支 | -20℃保存 | |
试剂三 | 液体15mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃避光保存 | 临用前加入1mL蒸馏水,充分溶解(即20μmol/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、超声清洗仪、可调式移液器、冰和蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取约0.1g组织,加入1mL提取液,冰浴匀浆,然后16000g,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌或细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细菌或细胞,加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);16000g,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、标准溶液的配制:把20μmol/mL标准品母液用蒸馏水稀释成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μmol/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(μmol/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (μmol/mL) |
S1 | 20 | 900 | 100 | 2 |
S2 | 2 | 500 | 500 | 1 |
S3 | 1 | 500 | 500 | 0.5 |
S4 | 0.5 | 500 | 500 | 0.25 |
S5 | 0.25 | 500 | 500 | 0.125 |
S6 | 0.125 | 500 | 500 | 0.0625 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至416nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 | |
试剂一 | 35 | 35 | - | - | |
蒸馏水 | - | 25 | - | 70 | |
试剂二 | 25 | - | - | - | |
样本 | 10 | 10 | - | - | |
迅速混匀,37℃恒温箱或者水浴锅保温30min | |||||
标准溶液 | - | - | 70 | - | |
试剂三 | 130 | 130 | 130 | 130 | |
混匀, 测定416nm处吸光值A,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A对照,ΔA标准=A标准-A空白。(注:每个测定管需设一个对照管,空白管只需测定1-2次。) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(μmol/mL)。
2、按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1μmol邻-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活单位(U)。
β-GAL活性(U/mg prot)=x×V2÷(V1×Cpr)÷T=0.233×x÷Cpr×D
3、按样本质量计算:
单位定义:每g组织每分钟产生1μmol邻-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活单位(U)。
β-GAL活性(U/g质量)=x×V2÷(W×V1÷V)÷T=0.233×x÷W×D
4、按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每104个细菌或细胞每分钟产生1μmol邻-硝基苯酚定义为一个酶活性单位(U)。
β-GAL活性(U/104cell)=x×V2÷(N×V1÷V)÷T=0.233×x÷N×D
5、按液体体积计算:
单位定义:每ml液体每分钟产生1μmol邻-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活单位(U)。
β-GAL活性(U/mL)=x×V2÷V1÷T=0.233×x×D
V:加入提取液体积,1mL; V1:加入反应体系中样本体积,0.01mL;
V2:反应体系总体积,0.07mL; T:反应时间,30min;
W:样本质量,g; D:样本稀释倍数,未稀释即为1;
N:细胞数量,以万计; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL。
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