||
一、产品简介:
α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase,α-GC,EC 3.2.1.20) 又叫α-D-葡萄糖苷水解酶,广泛分布于动植物和微生物中,是一类能够从含有α-糖苷键底物的非还原端催化水解 a-1,4-糖苷键,释放出葡萄糖,或将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成α-1,6 糖苷键,从而得到低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等物质。α-葡萄糖苷酶与淀粉及糖原等糖代谢密切相关,对维持生物体的正常生理功能起着重要作用。
α-葡萄糖苷酶可以水解对-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在 400nm 有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算α-葡萄糖苷酶活性。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体50mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 | 临用前加入13mL试剂二,充分溶解 |
试剂二 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体16mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 液体1mL×1支 | 4℃避光保存 | 5μmol/mL标准品母液 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、超声清洗仪、可调式移液器、冰、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取约0.1g组织,加入1mL提取液,冰浴匀浆,然后15000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌或细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细菌或细胞,加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、标准溶液的配制:把5μmol/mL(即5000nmol/mL)标准品母液用蒸馏水稀释成300、200、100、50、25、12.5 nmol/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(nmol/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (nmol/mL) |
S1 | 5000 | 940 | 60 | 300 |
S2 | 300 | 300 | 600 | 200 |
S3 | 200 | 200 | 200 | 100 |
S4 | 100 | 200 | 200 | 50 |
S5 | 50 | 200 | 200 | 25 |
S6 | 25 | 200 | 200 | 12.5 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至400nm。
② 操作表:
测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 | |
试剂一 | 120 | - | - | - |
试剂二 | 150 | 150 | - | - |
样本 | 30 | 30 | - | - |
混匀,37℃水浴/恒温培养箱 30min 后,立即沸水浴煮沸 5min(盖紧缠封口膜,防止水分散失),流水冷却。 | ||||
试剂一 | - | 120 | - | - |
充分混匀,8000g,4℃离心10min,取上清液待测。 | ||||
上清液 | 70 | 70 | - | - |
标准液 | - | - | 70 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 70 |
试剂三 | 130 | 130 | 130 | 130 |
混匀,室温静置2min后,于400nm下读取吸光值A,记为A测定、A对照、A标准、A空白。计算△A测定=A测定- A对照,△A标准=A标准-A空白(注:每个样本做一个自身对照,标准管和空白管只需测1-2次)。 |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(nmol/mL)。
2、按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位(U)。
α-GC活性(U/mg prot)==(x×V2)÷(V1×Cpr)÷T=20×x÷Cpr
3、按样本质量计算:
单位定义:每g组织在每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位(U)。
α-GC活性(U/g 质量) = (x×V2)÷(W×V1÷V)÷T=20×x÷W
4、按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每104个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位(U)。
α-GC活性(U/104 cell)=(x×V2)÷(N×V1÷V)÷T=20×x÷N
5、按液体体积计算:
单位定义:每mL样本每小时产生1nmol对-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活性单位(U)。
α-GC活性(U/mL)=x×V2÷V1÷T=20×x
V:加入提取液体积,1mL; V1:加入反应体系中样本体积,0.03mL;
V2:反应体系总体积,0.3mL; T:反应时间,0.5h; W:样本质量,g;
N:细胞或细菌总数,以万计; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL。
Archiver|手机版|科学网 ( 京ICP备07017567号-12 )
GMT+8, 2024-7-29 19:19
Powered by ScienceNet.cn
Copyright © 2007- 中国科学报社