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一、产品简介:
葡萄糖 (C6H12O6),是生物体产生能量分子ATP的主要来源,自然界分布最广且最为重要的一种单糖,也是鉴别水果等农产品品质的重要指标之一。 采用GOPOD氧化酶法对葡萄糖进行检测:葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,GOD)催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸,并释放H2O2;过氧化物酶(Peroxidase,POD)催化H2O2氧化4-氨基安替比林偶联酚,生成红色醌类化合物,通过吸光值变化即可定量检测葡萄糖的含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体10mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
试剂二 | 液体10mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL蒸馏水,充分溶解后,-20℃保存。(即50 μmol/mL标准品母液) |
工作液的配制:使用前将试剂一和试剂二 1:1 等体积混合,用多少配多少。 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、超声清洗仪、可调式移液器、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g 组织,加入1mL蒸馏水进行冰浴匀浆,置沸水浴中煮沸10min(盖紧,防止水分散失),冷却至室温,8000g,25℃离心10min,取上清待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细胞加入1mL蒸馏水,超声波破碎细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);置沸水浴中煮沸10min(盖紧,防止水分散失),冷却至室温,8000g,25℃离心10min,取上清待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 液体样本:澄清的液体样本直接检测,若浑浊则需8000g,25℃离心10min,取上清待测。
2、标准溶液的配制:把50 μmol/mL标准品母液用蒸馏水稀释成4、2、1、0.5、0.25、0.125 μmol/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(μmol/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (μmol/mL) |
Sx | 50 | 800 | 200 | 10 |
S1 | 10 | 600 | 400 | 4 |
S2 | 4 | 500 | 500 | 2 |
S3 | 2 | 500 | 500 | 1 |
S4 | 1 | 500 | 500 | 0.5 |
S5 | 0.5 | 500 | 500 | 0.25 |
S6 | 0.25 | 500 | 500 | 0.125 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长到505nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 20 | - | - |
标准溶液 | - | 20 | - |
蒸馏水 | - | - | 20 |
工作液 | 180 | 180 | 180 |
混匀,37℃避光反应25 min,测定505nm处吸光值A,分别记为A测定、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A空白,∆A标准=A标准-A空白。(注:空白管只需测定1-2次)。 |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(μmol/mL)。
2、按照组织蛋白浓度计算:
葡萄糖含量(μmol/mg prot)=x×V1÷(Cpr×V1)×D=x÷Cpr×D
3、按照样本质量计算:
葡萄糖含量(μmol/g质量)=x×V1÷(W×V1÷V) ×D=x÷W×D
3、按照细胞数量计算:
葡萄糖含量(μmol/104 cell)=x×V1÷(N×V1÷V) ×D=x÷N×D
4、按照液体体积计算:
葡萄糖含量(μmol/mL)=x ×D
V:加入提取液体积,1mL; V1:加入样本体积,0.02mL;
W:样本质量,g; N:细胞数量,以万计;
D:稀释倍数,未稀释即为1; Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
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GMT+8, 2024-7-16 13:33
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