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一、产品简介:
多糖是生物体中广泛存在的物质,是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物,它是生物体内重要的生物大分子,是维持生命活动正常运转的基本物质之一。 利用水提醇沉法提取总多糖,苯酚-硫酸法测定总多糖含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体11mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 自备 | 4℃保存 | 无水乙醇(AR) |
试剂三 | 自备 | 4℃保存 | 浓硫酸 |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL蒸馏水,充分溶解后,-20℃保存。(即10mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、40目筛、浓硫酸、无水乙醇和蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
组织样本:
①样本烘干研磨过 40 目筛,称取 5mg 样本,加入 1mL 蒸馏水,充分匀浆后于沸水浴中提取 2h(盖紧封口,以防止水分散失),冷却至室温,10000g,25℃离心 10min,取上清备用。
②取 0.2mL上步离心后的上清液至新 EP 管中,再加入 0.8mL 试剂二混匀,于 4℃静置过夜,取出后 10000g ,25℃离心 10min后弃上清,留沉淀(尽量保留沉淀)。
③向上步所得沉淀中加入1mL 蒸馏水,充分溶解沉淀后混匀待测。
2、标准溶液的配制:把10mg/mL标准品母液用蒸馏水稀释成0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125 mg/ml的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
Sx | 10 | 900 | 100 | 1 |
S1 | 1 | 750 | 250 | 0.25 |
S2 | 0.25 | 500 | 500 | 0.125 |
S3 | 0.125 | 500 | 500 | 0.0625 |
S4 | 0.0625 | 500 | 500 | 0.03125 |
S5 | 0.03125 | 500 | 500 | 0.015625 |
S6 | 0.015625 | 500 | 500 | 0.0078125 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至490nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 200 | - | - |
标准溶液 | - | 200 | - |
蒸馏水 | - | - | 200 |
试剂一 | 100 | 100 | 100 |
试剂三 | 500 | 500 | 500 |
①混匀,沸水浴10min(盖紧封口,以防止水分散失),取出后立即过冷水冷却至室温。 ②取200μL反应液于96孔板中,测定490nm处吸光值A,分别记为A测定、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A空白,∆A标准=A标准-A空白。(注:空白管只需测定1-2次)。 |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。
2、按样本质量计算:
多糖(μg/g 干重)=x×V1÷V2×V3÷W×1000×D =5000×x÷W×D
V1:醇沉后重新溶解后的体积,1mL; V2:进行醇沉的体积,0.2mL;
V3:提取时加入蒸馏水的体积,1mL; W:样本质量,g;
1000:mg 到 μg 的换算系数。
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