中国农业大学 杨淑华课题组 长期致力于植物冷信号应答的研究。在此前的研究中，已揭示CBF1-3通过太空COR基因的表达响应冷胁迫。G 蛋白调节因子 COLD1与水稻 G 蛋白 α SUBUNIT 1（RGA1）协作，通过控制寒冷诱导的 Ca2+ 流入来感知寒冷信号并增强水稻的耐寒性；然而，COLD1 如何调节 Ca2+ 流入仍是一个未知数。

   CNGC20是环核苷酸门控通道，在免疫过程中受到BAK1和BTL2共同调控，响应小肽信号，介导Ca2+内流，引起植物自噬。（Current Biology 2019；Cell 2023）

近日，杨淑华课题组在The Plant Cell杂志上发表题为《Differential phosphorylation of Ca²⁺-permeable channel CNGC20 modulates calcium-mediated freezing tolerance in Arabidopsis 》的论文，阐释了钙离子通道CNGC20的差异磷酸化调控植物耐冻性的分子机制。

研究内容：

1.作者筛选了CNGC和GLR的T-DNA突变体库，发现其中cngc20对冷更加敏感，回补材料可以恢复敏感表型，OE则显示更强的冷耐受表型。

为了检测CNGC20对冷的耐受是否与CFB相关，作者做了其和下游基因的转录分析，如图cngc20突变后这些基因表达受阻。

这说明：CNGC20通过影响CBF和下游COR基因实现冷耐受。

2.为了CNCG20是否在冷刺激中介导Ca2+转运，作者利用了水母荧光蛋白通过CCD检测了其受冷刺激后的钙信号强度，以及钙震荡情况，结果显示cngc20突变后，冷诱导的Ca2+吸收显著降低。CNCG20介导了冷刺激Ca2+内流的事件。

3. 为了挖掘CNCG20的调控模式，作者通过IP筛选到一个RLK基因PSYR1 [参与细胞扩张和植物对生物营养和坏死营养病原体的防御(Amano et al., 2007; Mosher and Kemmerling, 2013; Mosher et al., 2013)]。通过CoIP,pull-down和Bifc实验证明了其与CNGC20互作。

4. 既然互作，作者首先分析了PSY1R冷刺激后的磷酸化变化，Fig2D可见冷诱导PSY1R激酶活性，磷酸化信号增强。也分析了PSY1R的冷响应情况，结果显示psy1r对冷刺激更加敏感（EF），并且将PSY1R自磷酸化位点去磷酸化突变后，其冷耐受表型减弱。这说明PSY1R的激酶活性，调控了植株的冷耐受能力。

5. RLK和钙通道，作者很容易联想到激酶调控模式，于是作者也通过磷酸化质谱分析了PSY1R-KD对CNGC20-N/C端的调控作用，发现其中N端有61-75-77 3个Thr，C端有Thr526, Ser595 等5个点是潜在的磷酸化位点。而磷酸化实验则显示其中只有Thr61和Thr526缺失后显著抑制了CNGC20上的磷酸化信号。

利用phos-tag 作者也分析了体内磷酸化，C冷刺激后20的磷酸化信号增强，而在psy1r突变体中CNCG20磷酸化信号被削弱，和Thr双点突结果类似。这说明PSY1R通过Thr-61和526磷酸化CNCG20响应冷胁迫。

6. 为了进一步探究PSY1R是否影响CNGC20的活性，作者做了电压钳实验，结果显示PSY1R促进了CNCG20的活性，并且依赖于CNGC20的2个Thr和PSY1R的自磷酸化位点。

钙震荡实验也显示psy1r缺失会一定程度阻碍Ca响应过程。

7.为了CNGC20上的磷酸化对其功能的影响，作者构建了点突回补株系，可见A其无法恢复cngc20的表型；两者双突表型更倾向于cngc20，过表达CNGC20也无法恢复psy1r的磷酸化表型。

这说明PSY1R对于CNGC20调控冷耐受十分关键。

8. 同样在IP数据中作者还定位到一个CRPK1(冷耐受负调控子)，可能与CNGC20相关。通过Y2H，BIFC，CoIP和Pull-down实验，证实了CRPK1与CNGC20互作。

磷酸化质谱显示，CRPK1可能诱导CNGC20 C端7个磷酸化位点，多数分布于CNBD 区域，并且在CNCG19中也保守。于是作者构建了3,5,7突分析其磷酸化情况，结果显示，这7个磷酸化位点可能都与CRPK1调控CNGC20相关。

9. 电压钳检测结果CRPK1并不会影响CNGC20的电流，考虑到CNGC20在冷刺激下还有受到26蛋白酶体的降解影响，于是作者猜测CRPK1可能影响了CNCG20的降解。

FG，可见在crpk1中CNCG20比WT中降解更慢，这与CNGC20-7A结果类似。说明CRPK1对CNCG20的磷酸化会导致后者降解。

为了探究这是否受到冷刺激诱导，作者检测了转基因材料中CNGC20的降解情况，可见，crpk1缺失后，低温诱导的CNCG20降解显著变慢。这说明CRPK1诱导的CNCG20降解受冷诱导。

10. 为了解析CRPK1磷酸化CNCG20对植物抗冷的影响，作者构建了点突回补株系，可见20-7A（去磷酸）可以恢复cngc20冷敏感表型，而模拟磷酸化DE 20-7D则与cngc20表现相近。

双突表型也与cngc20更为接近。这些结果说明CRPK1在调控冷耐受中起到负调控作用。