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单宁含量检测试剂盒说明书
(货号:NM-W-0122 微量法100T/96S)
一、产品简介:
单宁是葡萄酒中所含有的两种酚类化合物其中的一种物质,尤其在红葡萄酒中含量较多,有益于心脏血管疾病的预防。
本试剂盒利用单宁在碱性环境下与磷钼酸反应,生成蓝色化合物,通过测定该生成物在750nm处有最大吸收峰来实现对单宁的定量检测。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100 mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体5.5mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
试剂二 | 液体5.5mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL蒸馏水,50℃加热充分溶解。(即2mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、30-50目筛、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取约0.1g新鲜样本;或者称取约0.02g烘干样本(将样本烘干至恒重,粉碎,过30-50目筛,得到烘干样本),加入1mL提取液,80℃水浴提取30min,12000rpm,25℃离心10min,取上清待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
2、标准溶液的配制:把2mg/mL标准品母液用蒸馏水稀释成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125mg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
S1 | 2 | 120 | 80 | 0.8 |
S2 | 0.8 | 100 | 100 | 0.4 |
S3 | 0.4 | 100 | 100 | 0.2 |
S4 | 0.2 | 100 | 100 | 0.1 |
S5 | 0.1 | 100 | 100 | 0.05 |
S6 | 0.05 | 100 | 100 | 0.025 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至750nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 10 | - | - |
标准溶液 | - | 10 | - |
试剂一 | 50 | 50 | 50 |
混匀,25℃室温件下,暗处静置3min | |||
试剂二 | 50 | 50 | 50 |
蒸馏水 | 90 | 90 | 100 |
混匀后,室温,准确反应30min,于750nm处读取吸光值A,分别记为A测定、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A空白,∆A标准=A标准-A空白。(注:空白管只需测定1-2次) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的W和D代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。
2、按照样本蛋白浓度计算:
单宁含量(mg/mg prot)=x×V÷(Cpr×V)×D=x÷Cpr×D
3、按照样本质量计算:
单宁含量(mg/g质量)=x×V1÷(W×V1÷V)×D=1.5x÷W×D
V:加入提取液体积,1.5mL; V1:反应中样本体积,0.01mL;
W:样品质量,g; D:稀释倍数,未稀释即为1;
Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
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GMT+8, 2024-6-27 01:25
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