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一、产品简介:
总黄酮,即黄酮类化合物;是植物重要的一类次生代谢产物,具有有较强的抗氧化活性,可捕捉活性氧自由基,降低氧化伤害,在果实中影响其色泽和风味;对植物的抗逆性和抗病虫害方面有重要作用。 在碱性亚硝酸盐溶液中,黄酮类化合物与铝离子形成在510nm处有特征吸收峰的红色络合物,测定反应产物在510nm处的吸光值,即可计算样品中总黄酮含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 自备 | 4℃保存 | 60%乙醇 (60 mL 无水乙醇和 40 mL 蒸馏水充分混匀) |
试剂一 | 液体1.8mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体1.8mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体12mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体2mL×1支 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃避光保存 | 临用前加入1mL试剂四,充分溶解。 (即10mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、30-50目筛、无水乙醇、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取约0.1g新鲜样本;或者称取约0.02g烘干样本(将样本烘干至恒重,粉碎,过30-50目筛,得到烘干样本),加入1.5mL的提取液(若鲜样需研磨均质),60℃振荡提取2h,12000rpm,25℃离心10min,取上清待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、标准溶液的配制:把10mg/mL标准品母液用提取液稀释成1、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05mg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
S1 | 10 | 450 | 50 | 1 |
S2 | 1 | 80 | 320 | 0.8 |
S3 | 0.8 | 200 | 200 | 0.4 |
S4 | 0.4 | 200 | 200 | 0.2 |
S5 | 0.2 | 200 | 200 | 0.1 |
S6 | 0.1 | 200 | 200 | 0.05 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至510nm。
② 操作表:
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用提取液适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的W和D代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。
2、按样本质量计算:
总黄酮含量(mg/g 质量)=x×V÷W×D=1.5x÷W×D
V:加入提取液体积,1.5mL; W:样品质量,g;
D:稀释倍数,未稀释即为1。
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