一、背景和目的

众所周知，慢性HBV感染有四个阶段：免疫耐受期、免疫清除期、非活动复制期和再活动期。很多学者认为，慢性HBV感染四阶段与肝细胞内HBcAg分布状态密切相关，而肝细胞内HBcAg分布又与病情轻重、病毒载量、治疗应答相关联，并影响着慢乙肝的进程和转归。目前在临床上，人们依赖病理学家的知识和经验来判断HBcAg的表达和分布，然而，由于病理切片自身的问题和主观经验的限制，常常出现主观偏倚。而且，肝细胞内HBcAg分布临床意义的研究虽然在某种程度上基本达成共识，但进一步深入探讨，存在学术分歧的地方仍然很多。分析其原因，一是如上评价方法的客观性尚有不足，二是研究者采用的评价方法并不统一，三是病例选择差异较大。此外，从中医理论看，肝细胞内HBcAg分布与前人的“伏邪”学说能否汇通和结合？中医补肾法为主是否有一定的疗效？这也是一个值得探讨的话题。

基于以上背景，本研究有4个目的：①从理论上探讨肝细胞内HBcAg分布状态引入中医伏气温病学说的可能性；②设计和验证一种较为客观的，定量的肝细胞内HBcAg分布的分层评价方法；③探讨肝细胞内HBcAg不同分布状态的临床意义（各病毒学、免疫学指标以及肝脏病理在HBcAg不同分布状态的表达情况）；④探讨补肾法治疗对肝细胞内HBcAg不同分布状态及各病毒学、免疫学指标的影响。

二、研究方法

1. 资料来源：来自导师领衔主持的国家重大科技专项课题“慢性乙肝病毒携带者的证候规律及中医药治疗方案研究”[20]中429例患者的病例资料。

2. 切片成像与图像处理：从深圳市中医院获取免疫组化染色切片，在第三人民医院病理科进行切片拍照，判断HBcAg阳染情况，并进行图像编号、标示。应用Image-Pro-Plus图像处理软件，在HIS 模式下，分别测出平均每个视野内的阳性细胞核个数、染色面积、平均光密度值，以及整个视野背景的平均光密度值。根据不同色度参数，可以得出阳性细胞浆HBcAg免疫组织化学阳性面积，亦可以分别计数HBcAg免疫组织化学阳性与阴性的细胞核。最后，分别获得HBcAg胞浆阳性面积和胞核阳性个数的数据。

3. 肝细胞内HBcAg分层评价方法：通过胞浆、胞核阳染率的计算公式，统计所有病例胞浆、胞核阳染率，待统计完毕，根据胞浆、胞核阳染率数据分布特点，定量划分HBcAg表达的不同层级，并探讨HBcAg分布与一般情况及病理学、病毒学、免疫学指标的关系，从而判断其临床意义。

4. 血清学指标检测：血清 HBV DNA 定量检测采用 PCR ELISA 全自动内标法（Roche 公司 COBAS AmpliprepTaqMan48系统），分别在治疗开始及第 24 周、52 周各检测 1 次；血清乙肝标志物 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，采用 Abott Laboratories ARCHITECT i2000sr 系统化学发光免疫法进行检测；血清 Th1/Th2 型细胞因子；IL-2、 IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α，采用 ELISA 方法检测。

5. “补肾法”疗效观察：“补肾法”是以补肾为主兼以健脾和清透的治疗方案。

补肾健脾方由仙灵脾30g、菟丝子10g、杜仲15g、怀牛膝15g、枸杞子15g、黄芪15g、白术15g、茯苓15g、猪苓10g、枳壳10g、印度叶下珠15g、丹参20g、三七5g、郁金15g组成。补肾清透方由印度叶下珠30g、菟丝子10g、仙灵脾30g、女贞子15g、旱莲草15g、柴胡10g、白芍10g、枳实10g、桃仁10g、甘草5g、虎杖15g。均每日一剂，分两次服用。进行治疗组和对照组HBcAg分布情况及病毒学、免疫学、病理学指标的对照研究，以评价其疗效。

三、研究结果

1. 肝细胞内HBcAg分布特点及其临床意义

（1）429例患者HBcAg胞浆和胞核阳性分布：0-2.5% HBcAg胞浆阳性表达的患者病例数最多，随着胞浆阳性表达升高，病例数逐渐减少，高于40%的阳性表达以个例情况为主；0-2.5%胞核阳性表达的患者病例数最多，超过总体样本40%，2.5-5.0%阳性表达病例数明显降低。

（2）HBcAg 胞浆与胞核分层情况：HBcAg 胞浆阳染显示，胞浆 HBcAg 阳染率<0.05% 设为 0 级，基本代表胞浆 HBcAg 表达阴性；0.05%＜胞浆阳染率＜5%设为 1级，5%＜胞浆阳染率＜10%设为 2 级，10%＜胞浆阳染率＜20%设为 3 级，胞浆 HBcAg阳染率>20%以上者设为 4 级。HBcAg 胞核阳染显示，胞核阳染率=0%设为 0 级，代表着细胞核 HBcAg 表达阴性；0%＜胞核阳染率＜2%设为 1 级，2%＜胞核阳染率＜10%设为 2 级，10%＜胞核阳染率＜20%设为 3 级，胞核阳染率＞20%设为 4 级。

（3）不同性别HBcAg分布表达：男性与女性无论在HBcAg胞浆还是胞核中表达的比较，均无统计学意义（P>0.05）。

（4）不同年龄段HBcAg分布表达：HBcAg胞核的表达主要集中于25-47岁，胞浆则集中在26-47岁。

（5）血清HBsAg在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：血清HBsAg滴度在0级HBcAg胞浆分布明显高于3级、4级（P值分别为<0.05，<0.01），1级、2级滴度表达皆高于4级（P值分别为<0.05，<0.05）。它在0级HBcAg胞核分布明显低于1、2、3、4级（P值分别为<0.05，<0.001，<0.001，<0.001），1级的表达明显低于2、3、4级（P值分别为<0.01，<0.05，<0.05）。

（6）血清HBeAg在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：血清HBeAg滴度在1级、3级HBcAg胞浆分布明显高于4级，有统计学意义（P值分别为<0.01，<0.05）。它在0级HBcAg胞核分布明显低于1、2、3、4级（P值分别为<0.001，<0.001，<0.001，<0.001），1级中表达低于3级（P<0.05）。

（7）血清HBV DNA在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：血清HBV DNA载量在

HBcAg胞浆分布无统计学意义（P>0.05）。它在0级HBcAg胞核分布明显低于1、2、3、4级（P值分别为<0.01，<0.001，<0.001，<0.001），1级低于2、3、4级（P值分别为<0.05，<0.01，<0.01）。

（8）IL-2在HBcAg胞浆、胞核分布中表达： IL-2在0级HBcAg胞浆分布明显高于1、2、3、4级（P值分别为<0.001，<0.001，<0.001，<0.001），1级高于2、4级（P值分别为<0.001，<0.01）。它在HBcAg胞核分布无统计学意义（P>0.05）。

（9）IL-4在HBcAg胞浆、胞核分布中表达： IL-4在0级HBcAg胞浆分布明显低于1、2、3级（P值分别为<0.05，<0.01，<0.001），1、2级皆低于3级，高于4级，有统计学意义（1级P值分别为<0.001，<0.01；2级P值分别为<0.01，<0.01），3级中表达高于4级（P<0.001）。它在2级HBcAg胞核分布明显高于1、3级（P值分别为<0.05，<0.05）。

（10）IL-10在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：IL-10在0、1级HBcAg胞浆分布皆高于3、4级，（0级P值<0.001，<0.05；1级P值<0.001，<0.01）2级低于1级，高于3级（P值分别为<0.01，<0.01）。它在0级HBcAg胞核分布低于1、4级（P值分别为<0.01，<0.05）。

（11）IFN-γ在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：IFN-γ在0级HBcAg胞浆分布明显低于1、2、3、4级（P值分别为<0.01，<0.01，<0.01，<0.001），2级低于4级（P <0.05）。它在HBcAg胞核分布表达无统计学意义（P>0.05）。

（12）TNF-α在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：细胞因子TNF-α在0级HBcAg胞浆分布明显高于1、2、3、4级（P值分别为<0.05，<0.001，<0.01，<0.001），1级高于2、4级（P值分别为<0.001，<0.01），2级低于3级（P<0.05）。它在0级HBcAg胞浆分布低于2、3级（P值分别为<0.01，<0.01），1级也低于2、3级（P<0.05，<0.01）。

（13）肝组织病理在HBcAg胞浆、胞核分布中表达：423例患者炎症活动度分级与胞浆HBcAg的分布率呈正相关，G0组患者HBcAg的分布率明显低于G1、G2和G3组（P<0.01，<0.001和<0.01），G2组明显高于G1、G3组（均P<0.05），但达到G2后有下降趋势，值得进一步验证。胞核HBcAg的分布率也以G2组明显高于其他各组（均P<0.05）。肝纤维化分期在HBcAg胞浆、胞核中的表达率均无统计学意义（均P>0.05）。

2. “补肾法”治疗后HBcAg表达、病理学、病毒学、免疫学指标变化

（1）HBcAg 胞浆、胞核阳染率变化：胞核阳染面积百分比均数下降了 1.0006，但P=0.539>0.05，没有统计学意义；而胞浆阳染率百分比均数上升了 5.2241，P=0.002<0.01，治疗组治疗前后，以及与对照组比较，有统计学意义。

（2）肝组织病理学表达：肝组织炎症分级、纤维化分期改善（P>0.05），无统计学意义。

（3）HBsAg滴度的变化：80例患者HBsAg阳性滴度下降了21632.51IU/ml，且P<0.05，有统计学意义；与93例安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后HBsAg阳性滴度下降了20689.3867 IU/ml，且P<0.05，有统计学意义。

（4）HBeAg滴度的变化：HBeAg阳性表达水平下降了134.3548IU/ml，P<0.05，有统计学意义；与安慰剂对照组相比，中药治疗组治疗后HBeAg阳性表达水平比对照组低115.0866IU/ml，P<0.05，有统计学意义。

（5）HBV DNA 载量变化：HBV DNA 指数下降了 0.5638 log，P<0.05，说明 DNA有所下降，且具有统计学意义；与安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后 HBV DNA 指数下降了 0.483 log，且 P<0.05，有统计学意义。

（6）IL-2表达水平的变化：IL-2均数上升了22.5121 pg/ml，P<0.05，有统计学意义；与安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后IL-2上升了21.3036 pg/ml，且P<0.05，有统计学意义。

（7）IL-4表达水平的变化：IL-4下降了42.5714 pg/ml，P<0.001，有统计学意义，与安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后IL-4下降了42.0477 pg/ml，P<0.01，有统计学意义。

（8）IL-10表达水平的变化：IL-10下降了1.7844 pg/ml，但没有统计学意义（P>0.05），与安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后IL-10下降了0.962 pg/ml，无统计学意义。

（9）TNF-α表达水平的变化：TNF-α下降了15.3377pg/ml，P<0.05，有统计学意义；与安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后TNF-α下降了13.3355 pg/ml，P<0.05，有统计学意义。

（10）IFN-γ表达水平的变化：IFN-γ上升了1.1039 pg/ml，P>0.05，无统计学意义；与安慰剂对照组治疗后相比，中药治疗组治疗后IL-2上升了1.6257 pg/ml，P>0.05，无统计学意义。

四、结论

1. 建立在肝细胞内HBcAg胞浆、胞核阳染分布数据基础上的量化分层评价，为探讨病毒学、免疫学、病理学指标与肝细胞内HBcAg不同分布状态的关系提供了一种较为客观的方法。

2. 随着肝细胞内HBcAg分级的递增（胞浆、胞核阳染率的增高），HBsAg、HBeAg、HBV DNA、IL-10、TNF-α以在HBcAg胞核中的表达为主，免疫细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ则以在HBcAg胞浆中的表达为主。

3. “补肾法”可以通过上调IL-2，下调IL-4、IL-10 、TNF-α的表达水平，调整机体免疫状态，降低了血清HBsAg、HBeAg的滴度和HBV-DNA的载量，在一定程度上改善慢性HBV携带者的免疫耐受状态，阻止了病毒对肝细胞的继续侵蚀，包括HBV DNA载量的降低。

4. 根据肝细胞内HBcAg胞浆阳染率与肝组织炎症活动度呈正相关，胞核阳染率与HBV DNA载量呈正相关的定量分析，以及补肾法治疗后HBcAg胞浆阳染率上升的表现，符合伏邪“由里出表”的临床特点，说明肝细胞内HBcAg分布状态可以作为伏邪部位引入中医伏气温病理论。

资料来源：广州中医药大学2014届博士论文