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一、产品简介:
体系内各种抗氧化大分子、小分子和酶的总水平,反映了该体系内的总抗氧化能力(T-AOC)。T-AOC能更全面地评价体液、细胞和组织匀浆、食品和饮料的抗氧化剂含量,广泛应用于医学、食品科学等相关研究。
ABTS法可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定,是使用最广泛的间接检测方法。ABTS经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子ABTS自由基,在405nm处有最大吸收峰。当有抗氧化剂存在时,ABTS 自由基被清除,会发生脱色反应。因此可通过检测吸光度的变化,并以标准品作为对照体系来量化抗氧化物质的抗氧化能力。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体70mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂×1支 | 4℃避光保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部,加入1mL蒸馏水,充分溶解备用。 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部,加入2.8mL蒸馏水,充分溶解备用。 |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1.4mL提取液,充分溶解。 (即20μmol/mL标准品母液) |
工作液配制:临用前将加水溶解后的试剂一和试剂二按照1:1比例混合,避光反应12h后(二天内用完),再用无水乙醇稀释30倍,即为ABTS工作液,现配现用。 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、无水乙醇和蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取约0.1g新鲜组织或者称取约0.02g烘干样本(将新鲜样本置于60℃烘箱烘干至恒重,粉碎,过40目筛,得到烘干样本),加入1mL提取液(若鲜样需研磨均质),于60℃,200-300W条件下超声提取30min(间隔5min振荡混匀一次),若有损失需用提取液定容至1mL。12000rpm,25℃离心10min,取上清待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000rpm,25℃离心10min,取上清待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、标准溶液的配制:把20μmol/mL标准品母液用提取液稀释成0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05μmol/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(μmol/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (μmol/mL) |
Sx | 20 | 150 | 50 | 5 |
S1 | 5 | 336 | 64 | 0.8 |
S2 | 0.8 | 25 | 75 | 0.6 |
S3 | 0.8 | 100 | 100 | 0.4 |
S4 | 0.4 | 100 | 100 | 0.2 |
S5 | 0.2 | 100 | 100 | 0.1 |
S6 | 0.1 | 100 | 100 | 0.05 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至405nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 10 | 10 | - | - |
标准溶液 | - | - | 10 | - |
提取液 | - | 190 | - | 10 |
工作液 | 190 | - | 190 | 190 |
混匀后,室温,避光反应6min,测定405nm处的吸光值A,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。(注:空白管只需做1-2次。) |
4、正式实验:
① 不同样本清除 ABTS 自由基的能力可能相差很大,为保证实验结果的准确性,样本要根据预实验结果进行适当调整(如清除率大于80%,建议将提取的样本进行适当稀释后测定;如清除率小于20%,建议加大样本质量),并将改变后的W和D代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的清除率(%)为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将清除率带入方程得到x(μmol/mL)。
标准品ABTS自由基清除率(%)=[(A空白-A标准)÷A空白×100]%
2、样本ABTS自由基清除率(%)=[(1-(A测定-A对照)÷A空白)×100]%
3、定义:用从标准曲线上获得的抗氧化剂的量来表示样本的ABTS自由基清除能力。
4、按样本质量计算:
ABTS自由基清除能力(μmol/g质量)=x×V1÷(V1÷V×W) ×D=x÷W×D
5、按细菌/细胞计算:
ABTS自由基清除能力(μmol/104 cell)=x×V1÷(V1÷V×N) ×D=x÷N×D
6、液体样本:
ABTS自由基清除能力(μmol/mL)=x×D
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.01mL;
W:样本质量,g; N:细胞数量,以万计;
D:稀释倍数,未稀释即为1。
注意事项:
样本建议当天提取,当天检测。
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GMT+8, 2024-9-26 12:31
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