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一、产品简介:
体系内各种抗氧化大分子、小分子和酶的总水平,反映了该体系内的总抗氧化能力(T-AOC)。T-AOC能更全面地评价体液、细胞和组织匀浆、食品和饮料的抗氧化剂含量,广泛应用于医学、食品科学等相关研究。
在酸性环境下,抗氧化物质还原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ的能力反映了总抗氧化能力。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体120mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体2mL×1支 | 4℃避光保存 | |
试剂三 | 液体2mL×1支 | 4℃避光保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL甲醇,充分溶解。 (即50μmol/mL标准品母液) |
工作液配制:将试剂一、试剂二、试剂三按10:1:1的比例混合,使用前37℃预热10min,现配现用,注意避光。 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、甲醇、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g样本,加入1mL提取液进行冰浴匀浆,12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 液体样本:水溶性样本可直接检测。若是油性样本,可用提取液溶解后再取上清检测。
2、标准溶液的配制:把50μmol/mL标准品母液用提取液稀释成8、4、2、1、0.5、0.25μmol/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(μmol/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (μmol/mL) |
S1 | 50 | 168 | 32 | 8 |
S2 | 8 | 100 | 100 | 4 |
S3 | 4 | 100 | 100 | 2 |
S4 | 2 | 100 | 100 | 1 |
S5 | 1 | 100 | 100 | 0.5 |
S6 | 0.5 | 100 | 100 | 0.25 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至590nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 5 | - | - |
标准溶液 | - | 5 | - |
蒸馏水 | 25 | 25 | 30 |
工作液 | 170 | 170 | 170 |
混匀后,室温(25℃),准确反应10min,测定590nm处的吸光值A,分别记为A测定、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A空白,∆A标准=A标准-A空白。(注:空白管只需做1-2次。) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的W和D代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(μmol/mL)。
2、定义:用从标准曲线上获得的抗氧化剂的量来表示样本的总抗氧化能力。
3、按蛋白浓度计算:
总抗氧化能力(μmol/mg prot)=x×V1÷(V1×Cpr)×D=x÷Cpr×D
4、按样本质量计算:
总抗氧化能力(μmol/g质量)=x×V1÷(V1÷V×W)×D=x÷W×D
5、按液体样本计算:
总抗氧化能力(μmol/mL)=x×D
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.005mL;
W:样本质量,g; D:稀释倍数,未稀释即为1;
Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
注意事项:
1、由于本方法是显蓝色测定吸光度值,因此尽量避免使用在酸性条件下呈蓝色或者接近蓝色的样本,否则对本试剂盒的检测结果产生干扰;
2、样本中样本中不宜添加Tween、Triton和NP-40等去垢剂和DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的还原剂。
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