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脯氨酸(PRO)含量检测试剂盒说明书 (货号:NM-W-0105 微量法100T/96S)

已有 217 次阅读 2024-5-22 16:56 |系统分类:科研笔记

一、产品简介:

植物体内游离脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外,由于脯氨酸亲水性极强,能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程,因而能降低凝固点,有防止细胞脱水的作用。在低温条件下,植物组织中脯氨酸含量增加,可提高植物的抗寒性,因此,亦可作为抗寒育种的生理指标。

脯氨酸经磺基水杨酸(SSA)提取后,与酸性茚三酮反应生成红色物质,产物经甲苯萃取,测定520 nm 处吸光值变化即可定量检测脯氨酸的含量。

二、试剂盒组分与配制:

试剂名称

规格

保存要求

备注

提取液

液体120mL×1

4℃避光保存

试剂一

自备

4℃保存

冰乙酸

试剂二

液体30mL×1

4℃避光保存

试剂

自备

4℃保存

甲苯

标准品

粉剂×1

4℃保存

临用前加入1mL蒸馏水,充分溶解(即10mg/mL标准品母液

三、需自备的仪器和用品:

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器冰乙酸甲苯、蒸馏水。

四、操作步骤

建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!

1、预实验样本制备

组织样本:称取0.1g样本加入1mL提取液进行匀浆于沸水浴震荡提取10min冷却至室温,12000rpm25℃离心10min,取上清待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10的比例进行提取。

细菌/细胞样本:建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);之后置于沸水浴振荡提取10min冷却至室温,12000rpm25℃离心10min,取上清待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~10001的比例进行提取。

血清(浆)样:取0.1mL血清(浆)加入0.9mL提取液,充分混匀之后置于沸水浴振荡提取10min冷却至室温12000rpm25℃离心10min,取上清待测。【注】若增加样本量,可按照血清(浆)体积(mL):提取液体积(mL)15~10的比例提取。

2标准溶液的配制:10mg/mL(即10000μg/mL标准品母液用蒸馏水稀释成40201052.51.25μg/mL的标准溶液备用。

编号

稀释前浓度(μg/mL

稀释液体积

μL

标准液体积

μL

稀释后浓度

μg/mL

Sx

10000

900

100

1000

S1

1000

960

40

40

S2

40

500

500

20

S3

20

500

500

10

S4

10

500

500

5

S5

5

500

500

2.5

S6

2.5

500

500

1.25

3、预实验上机操作:

酶标仪预热30min以上,调节波长至520nm

操作表

试剂名称(µL

测定管

标准管

空白管

样本

250

-

-

标准溶液

-

250

-

蒸馏水

-

-

250

试剂一

250

250

250

试剂

250

250

250

混匀后,于沸水浴中加热30min(盖紧封口,防止盖子爆开水分散失),冷却至室温。

试剂三

500

500

500

振荡混匀 30s,静置片刻(使色素完全转至上层甲苯中);200μL上层溶液至96孔板中,测定520nm吸光值A,分别记为A测定、A标准、A空白计算ΔA测定=A测定-A空白∆A标准=A标准-A空白(注:空白管只需测定1-2次。)

4、正式实验:

 预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本提取液适当稀释后再进行测定低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定并将改变后的WD代入公式计算;

 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;

正式实验按照预实验操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。

五、结果计算:

1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到xμg/mL)。

2按照组织蛋白浓度计算 

脯氨酸含量(μg/g质量)=x×V1÷Cpr×V1×D=x÷Cpr×D

3、按照样本质量计算 

脯氨酸含量(μg/g质量)=x×V1÷W×V1÷V×D=x÷W×D

4按细菌或细胞数量计算

脯氨酸含量(μg/104 cell)=x×V1÷(N×V1÷V)×D=x÷N×D

5、按照血清(浆)体积计算

脯氨酸含量(μg/mL)=x×V1÷V1×V2÷V×D=10×x×D

V加入提取液体积,1mL;           V1:反应中样本体积,0.25mL

V2加入血清(浆)的体积,0.1 mL   N细胞数量以万计;

W样品质量,g   D稀释倍数,未稀释即为1   Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL

注意事项

提取液中含有蛋白沉淀剂,若采用蛋白浓度计算方式,需单独使用PBS提取后再测定蛋白浓度



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