一、产品简介：

植物体内游离脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低凝固点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸含量增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。

脯氨酸经磺基水杨酸（SSA）提取后，与酸性茚三酮反应生成红色物质，产物经甲苯萃取，测定520 nm 处吸光值变化即可定量检测脯氨酸的含量。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、冰乙酸、甲苯、蒸馏水。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取0.1g样本，加入1mL提取液进行匀浆，于沸水浴震荡提取10min，冷却至室温，12000rpm，25℃离心10min，取上清待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：建议500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；之后置于沸水浴振荡提取10min，冷却至室温，12000rpm，25℃离心10min，取上清待测。【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。

③ 血清（浆）样本：取0.1mL血清（浆）加入0.9mL提取液，充分混匀，之后置于沸水浴振荡提取10min，冷却至室温，12000rpm，25℃离心10min，取上清待测。【注】若增加样本量，可按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例提取。

2、标准溶液的配制：把10mg/mL（即10000μg/mL）标准品母液用蒸馏水稀释成40、20、10、5、2.5、1.25μg/mL的标准溶液备用。

3、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至520nm。

② 操作表：

4、正式实验：

① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围：高于最高值建议将待测样本用提取液适当稀释后再进行测定，低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定，并将改变后的W和D代入公式计算；

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验操作步骤进行（标准管和空白管预实验已做，正式实验可选做）。

五、结果计算：

1、以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA测定带入方程得到x（μg/mL）。

2、按照组织蛋白浓度计算： 

脯氨酸含量(μg/g质量)=x×V1÷（Cpr×V1）×D=x÷Cpr×D

3、按照样本质量计算： 

脯氨酸含量(μg/g质量)=x×V1÷（W×V1÷V）×D=x÷W×D

4、按细菌或细胞数量计算：

脯氨酸含量(μg/10⁴ cell)=x×V1÷(N×V1÷V)×D=x÷N×D

5、按照血清（浆）体积计算：

脯氨酸含量(μg/mL)=x×V1÷（V1×V2÷V）×D=10×x×D

V：加入提取液体积，1mL；           V1：反应中样本体积，0.25mL；

V2：加入血清（浆）的体积，0.1 mL；   N：细胞数量，以万计；

W：样品质量，g；   D：稀释倍数，未稀释即为1；   Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。

注意事项：

提取液中含有蛋白沉淀剂，若采用蛋白浓度计算方式，需单独使用PBS提取后再测定蛋白浓度。