一、产品简介:
过氧化物酶(Peroxidase,POD)广泛分布于生物界,在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用,如清除细胞内的有害物质H2O2、保护酶蛋白及促进植物细胞木质素的形成等。因此,POD酶活性是衡量植物在胁迫情况下的一个非常重要的生理指标。
POD催化H2O2氧化特定底物生成红棕色产物,该产物在470nm有特征光吸收。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 规格 保存要求 备注
提取液 液体120mL×1瓶 4℃保存
试剂一 液体20mL×1瓶 4℃保存
试剂二 液体1mL×1支 4℃避光保存
试剂三 液体1mL×1支 4℃避光保存
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g样本,加入1mL提取液进行冰浴匀浆,12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000rpm,4℃离心10min,取上清置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清置冰上待测。
2、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至470nm。
② 测定前将试剂一、二和三解冻至37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)。
③ 操作表:
试剂名称(μL) 测定管
样本 5
试剂一 175
试剂二 10
试剂三 10
在96孔板中按顺序加入上述试剂,迅速混匀并计时,记录470nm下30s时的吸光值A1和1min30s时吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。
3、正式实验:
① 若ΔA小于0.005,可将反应时间延长到5min,计算时除以改变后的反应时间即可;若ΔA大于0.9或者反应液中有较多气泡产生,可将样本用提取液进行稀释,计算时乘以相应的稀释倍数即可;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。
五、结果计算:
a、用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下:
1、按组织蛋白浓度计算:
活性单位定义:每mg组织蛋白每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位(U)。
POD活性(U/mg prot) =ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.01÷T=4000×ΔA÷Cpr
2、按组织样本质量计算:
活性单位定义:每g组织每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位(U)。
POD活性(U/g 质量)=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.01÷T =4000×ΔA÷W
3、按细胞数量计算:
活性单位定义:每104个细胞每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位(U)。
POD活性(U/104cell)=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.01÷T=4000×ΔA÷N
4、按血清(浆)体积计算:
活性单位定义:每mL血清(浆)每分钟在每 mL反应体系中使470nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位(U)。
POD活性(U/mL)=ΔA×V2÷V1÷0.01÷T =4000×ΔA
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.005mL;
V2:反应体系总体积,0.2mL; T:反应时间,1min;
W:样品质量,g; N:细胞数量,以万计;
Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
b、用 96 孔板测定的计算公式如下:
1、按组织蛋白浓度计算:
活性单位定义:每mg组织蛋白每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.005为一个酶活单位(U)。
POD活性(U/mg prot) =ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.005÷T=8000×ΔA÷Cpr
5、按组织样本质量计算:
活性单位定义:每g组织每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.005为一个酶活单位(U)。
POD活性(U/g 质量)=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.005÷T =8000×ΔA÷W
6、按细胞数量计算:
活性单位定义:每104个细胞每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.005为一个酶活单位(U)。
POD活性(U/104cell)=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.005÷T=8000×ΔA÷N
7、按血清(浆)体积计算:
活性单位定义:每mL血清(浆)每分钟在每 mL反应体系中使470nm处吸光值变化0.005为一个酶活单位(U)。
POD活性(U/mL)=ΔA×V2÷V1÷0.005÷T =8000×ΔA
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.005mL;
V2:反应体系总体积,0.2mL; T:反应时间,1min;
W:样品质量,g; N:细胞数量,以万计;
Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
注意事项:
如一次测定的样本数量较多,试剂一、试剂二、试剂三按照比例混合成工作液,在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)放置10min,测定时加入195μL工作液即可。
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