aBIOTECH | 阮珏团队开发快速和特异性检测miRNA/短RNA片段的方法

miRNA是一种内源性的非编码单链短RNA（长度为18-24个核苷酸），参与细胞增殖、分化和细胞死亡等多个生物学过程，其异常表达与癌症等疾病密切相关。因此miRNA检测是癌症预防、诊断和监测的一种有效策略。由于miRNA长度短、序列相似性高和低丰度的内在特性，准确和超灵敏检测miRNA仍面临挑战。

近日，中国农业科学院农业基因组研究所阮珏团队在aBIOTECH上发表了题为 "A sensitive one-pot ROA assay for rapid miRNA detection"的研究论文，开发了一种基于滚环扩增的一锅等温检测方法ROA，用于快速和特异性检测miRNA和短RNA片段。

该方法将靶标的识别，线性滚环扩增（linear RCA）和引物生成（primer generation）整合到一管中，而且无需专用仪器，简化了操作流程并缩短了检测时间（1 h）。经测试，该方法适用于低丰度样本检测，其检测限（LOD）达到6 pM。检测结果读取简单，且在实际样本测试中其准确性与RT-qPCR一致。

图1 ROA原理图

ROA的原理（图1）所示，针对待测miRNAs设计环形探针，检测时环形探针与目标miRNAs在57℃-60℃下特异性结合，在Bst聚合酶的作用下进行滚环扩增，并在反应中添加一定比例的dUTP和识别U的限制性内切酶，反应体系中新生成的DNA单链会被UDG打断，从而作为新引物继续触发新的滚环扩增，在短时间内实现指数扩增。此外，我们使用了SYBR Gold作为指示剂可以对荧光信号进行快速、直观地检测，增强了该方法的通用性。

ROA具有高灵敏性，在各项参数优化后，能够在1 h内将皮克（pg）量级的模板扩增到微克（μg）水平。在对18-24 nt不同长度的miRNAs测试中，ROA展现出很好的适应性。在特异性测试中，ROA对单核苷酸错配敏感，尤其对3’端的错配更为突出，相较其他UDG-aided RCA, ROA的特异性更好。

图2 MS2噬菌体检测结果

传统病毒RNA检测需要逆转录过程，这需要尽可能保证RNA的完整性，对实验环境和操作有很高要求。基于ROA可以直接对短RNA进行扩增的功能基础，本研究进一步探索了ROA对RNA病毒的检测能力。我们以MS2噬菌体为测试对象，通过设计特异性环形探针，简单的裂解（高温）和打断（RNase III），靶向捕获和扩增，ROA在不去宿主的情况下依然可以特异性检测MS2噬菌体的目标RNA（图2）。结果表明，ROA具有方便、快速检测RNA病毒的潜力。

中国农科院基因组所阮珏研究员为该论文通讯作者。基因组所客座硕士毕业生侯志浩，联培硕士生邓文鹏为该论文共同第一作者。基因组所常玉晓研究员、王鑫杰研究员和MD安德森癌症中心王开乐博士参与了该研究工作。该研究得到了国家重点研发计划、深圳市科技创新委员会和中国农业科学院科技创新工程的资助与支持。

引用本文：

Hou, Z., Deng, W., Li, A. et al. A sensitive one-pot ROA assay for rapid miRNA detection. aBIOTECH (2024). https://doi.org/10.1007/s42994-024-00140-0

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