在做扩增子测序时，测序公司提供的原始fastq格式序列可能包含引物甚至barcode等多余碱基，结构如下所示：

[barcode等多余碱基][前引物][目的序列][后引物][多余碱基]

有些测序公司可能会提供去除了barcode甚至引物的fastq格式序列，然而如果使用的去除方法不合适（例如直接按碱基数截去序列两端的若干碱基），可能部分序列的引物或barcode去除不完整。由此可能导致划分OTU/ASV时，多出来一些错误的OTU/ASV。更有甚者，我遇到过某些公司提供的原始序列出现同一条序列出现2次以上的情况 (这些冗余序列的编号和内容完全一致)，以及一条序列包含2对引物的情况，尽管这种错误所占比例较低。

为此，我编写了一个Perl脚本trim_primer_in_fq.pl，用于检测fastq格式序列中的引物，在引物外侧的多余碱基（例如barcode）将被截去，可以选择去除引物，同时也可以去除冗余序列和含有多对引物的错误序列。

这个脚本需要使用命令行执行，例如Windows系统的命令提示符（CMD）、Linux和macOS系统的终端。运行脚本时，如果不提供任何参数，会显示脚本的帮助信息（例如全部参数的说明）。当然，电脑上得安装有perl语言，可以从网上下载Strawberry Perl或ActivePerl安装。该脚本用法如下：

perl trim_primer_in_fq.pl -i [fastq文件] -l [引物列表文件] -d [输出目录] <可选参数>

(1) 必选参数：

-i: 建议使用双端拼接后的序列，可以是单个文件，也可以是若干文件，例如：-i "fq/*.fastq"，表示fq目录下的所有扩展名为fastq的文件，使用通配符*时请务必使用英文引号。

-d: 输出目录，脚本会新建这个目录，将结果输出到该目录内，不要和输入目录相同！

-l: 引物列表文件，包含两行，依次是前引物、后引物序列及名称（请使用Tab制表符分隔），支持简并碱基，例如：

GMRCCIGGIGTIGGYTGYGC    nifH-2F

TTGTTGGCIGCRTASAKIGCCAT    nifH-3R

(2) 可选参数（可以缺省，取默认值）：

-r: 去除多余碱基时，是否去除引物？0 - 保留引物，1 - 去除引物，默认1。

-s: 如果一条序列只包含前后引物中的1条，是否保留该序列？0 - 否，1 - 是，默认0。

-c: 当检测到任一引物多次在一条序列中出现时，是否去除该序列？0 - 否，1 - 是，默认1。

建议用这个脚本处理双端拼接后的fastq格式序列 (不宜用于处理单端序列)，输出的fastq文件可进一步做序列质控等分析。此外会输出日志文件，汇总每个文件的引物检测结果；如果发现某个fastq文件包括冗余序列，则输出冗余序列编号。

此外，再分享两个与序列分析有关的Perl脚本：

1. rename_seqid_for_usearch.pl

该脚本可将fasta/fastq格式序列的编号重命名为"文件名_编号;barcodelabel=文件名;"。 重命名后，来自不同样本的序列可合并到一个文件中进行后续分析（例如OTU聚类），Qiime和Usearch软件可识别序列的样本来源，从而生成OTU/ASV表。

例如，文件"S1.fasta"的第一条序列重命名为"S1_1;barcodelabel=S1;"，第二条序列重命名为"S1_2;barcodelabel=S1;"。

用法如下：

perl rename_seqid_for_usearch.pl -i [输入文件] -f [输入文件格式] <可选参数>

-i: 如有多个文件，可以使用通配符*（例如"*.fq"），或多个文件之间以英文分号隔开（例如"1.fq;2.fq;3.fq"），请务必使用英文引号！

-f: 输入文件的格式，0 - fasta，1 - fastq

2. fastq2fasta.pl

该脚本用于将fastq格式序列转为fasta格式。用法如下：

perl fastq2fasta.pl [输入文件]

以上自编Perl脚本可以从GitHub下载：https://github.com/PeterRui/perl4amplicon

如果GitHub打不开，也可以从这篇文章的补充材料下载Data Sheet 2.zip：

Rui J, Zhao Y, Cong N, Wang F, Li C, Liu X, Hu J, Ling N and Jing X (2023) Elevational distribution and seasonal dynamics of alpine soil prokaryotic communities. Front. Microbiol. 14:1280011. doi: 10.3389/fmicb.2023.1280011