科学家成功复活4.6万年前冷冻线虫

近日，俄罗斯科学院的研究人员在西伯利亚永冻土中发现了两种线虫。放射性碳测年结果表明，这些线虫个体自更新世晚期（约 4.6 万年前）以来一直处于隐生状态，存活至今。研究人员在实验室条件下复活了这种线虫，并在几个月时间内由最初几头虫成功繁殖到数万头。项研究将最长隐生生物时间延长了数万年，相关结果于7月27日发表在《PLOS Genetics》杂志上。

早在2018年，俄罗斯科学院的阿纳斯塔西娅博士（Anastasia Shatilovich）在一项科考项目中从西伯利亚永久冻土层的一个化石洞穴中发现了一种线虫。发现时这种线虫以冷冻的状况存在于淤泥沉积物中。在返回实验室后，他们在实验室对线虫进行了解冻，并尝试进行人工培养。在对洞穴中的植物材料进行的放射性碳分析后，他们惊奇的发现，这些位于地表以下 40 米的冰冻沉积物自更新世晚期（距今 45839 年至 47769 年）至今从未解冻过。与此同时，德国马普分子细胞生物学和遗传学研究所秀丽隐杆线虫专家泰穆拉斯（Teymuras Kurzchalia）教授注意到了这个发现，并与Shatilovich博士取得了联系。随后，他们对这种线虫的形态与基因组进行了分析。结果显示，该线虫属于以前未被描述的物种，研究人员对其定名为科雷马盆咽线虫Panagrolaimus kolymaensis，以纪念他的发现地科雷马河。基因组分析发现，科勒曼盆咽线虫中具有秀丽隐杆线虫进入2龄滞育态（一种隐生态）所需的大部分基因。在随后的生理生化研究中，研究小组发现冷冻前的轻度脱水暴露会促使线虫产生海藻糖，该物质已在多种生物上证明与提高耐寒能力有关，如海藻糖处理的草履虫可在零下80摄氏度的环境中存活了480天，解冻后存活率和繁殖能力没有任何下降。海藻糖的产生为线虫进入隐生状态做好准备，提高了在低温下的存活率。研究的作者之一菲利普-希弗（Philipp Schiffer）认为：这项发现对于了解生物进化过程至关重要，复活几万或几十万年前的生物能够让我们对历史上可能已经灭绝的生物重新进行研究。

科勒曼盆咽线虫发现的位置（图片来源：Shatilovich et al., 2023, PLOS Genetics）

科勒曼盆咽线的形态特征（图片来源：Shatilovich et al., 2023, PLOS Genetics）

线虫冷冻与复活可能吗？

这项研究一经发表，便在世界范围内引起了广泛关注。国内如央视财经、科技日报等权威媒体也纷纷转载报道，一时间成为大家热议的话题。对于大多数普通群众而言，最为惊讶的冷冻的动物可以复活，但对专业线虫分类进化研究者而言，这个发现完全不意外。线虫中的盆咽属（Panagrolaimus）是一种极具耐受性的类群，他们以细菌为食，生长周期短（通常4-10天一个时代），其中多个种可以进行孤雌生殖。目前已知该属线虫能够耐受低温冷冻、低氧、干燥、多种重金属离子等逆境。除了此次发现的科雷马盆咽线虫外，大卫盆咽线虫（P. davidi）也具有极强的冷冻耐受性。该线虫于1989年首次被新西兰奥塔哥大学（University of Otago）大卫沃顿 David Wharton教授在南极分离到。研究显示，在冷冻过程中，大卫盆咽线虫的排泄口和口腔等部分最早开始结晶，最终细胞膜内也可大量形成冰晶。有意思的是，与大多数动物不同，冰晶的形成似乎并不会影响细胞结构，再融化后，细胞膜结构功能仍然正常，线虫能够迅速的恢复运动，并正常的进行繁殖。大卫盆咽线虫的耐寒性与培养时间、线虫年龄以及温度暴露背景密切相关。随后，以这种线虫为模型，大卫沃顿教授开展了长达三十多年的研究，深入解析了耐寒的理化和分子机制，包括发现一种可以抑制在结晶的结冰激活蛋白，以及从基因组功能上阐述耐寒性的形成。另一个重要的耐低温线虫是属于绕线目的莫瑞绕线线虫Plectus murrayi。该线虫同样以细菌为食，在南极洲有较为广泛的分布，能够在脱水及冷冻条件下生存。美国杨百翰大学（Brigham Young University）的Byron Adams教授等人围绕这种线虫开展长期的研究，并于2020年在冷泉港会议协议上发文建议将该线虫发展为研究线虫逆境与抗性的模式生物。截止目前，多国研究人员正在围绕莫瑞绕线线虫进化、群体遗传、转录组、基因组，深入解析这种线虫的耐寒耐脱水机制，并已经初步取得了一系列进展。恶魔线虫（Halicephalobus mephisto）与盆咽属同属于盆咽科，在进化关系上高度相关，同样具有很高的抗逆性。2011年Nature杂志发文报道它能够在金矿矿井下数公里深生存，是目前已知最深的后生生物（metazoan）。著名的秀丽隐杆线虫虽然没有这些线虫抗逆性强，但也可以在液氮中保存，这个特性也成就了其成为最重要的模式生物之一。除线虫外，在2021年，俄罗斯科学院的Shmakova等人在西伯利亚永久冻土中发现了距今2.4万年前的蛭形轮虫（Bdelloid rotifers）,并成功的对其进行了复活（Shmakova et al., 2021, Current Biology），这一发现在当时也引起了轰动。

2015年读博期间，我接手了一个来自挪威科考项目收集来的土样。该土样采集自北极圈内的永久冻土，表面附着有少量苔藓地衣。有趣的是，将土壤浸泡12小时后采用常规方法提取并未见任何线虫。经过周末两天浸泡，当我返回实验室再次检查样品时，分离液中出现了不少线虫。当时并未留意这个现象，但现在回想起来，这些线虫应该也处于冷冻的隐生状态，故而需要更长时间才能复苏并分离到。经过形态鉴定，其中种类非常单一，均为盆咽线虫与头叶类的Scottnema，都是典型抗逆性很强的种类。其中的Scottnema近年来也在南极有发现，但其冷冻相关机理尚未见研究。这两种线虫都非常好养。以细菌为食物，在培养皿内3-5天即可繁殖一代，一个月后培养皿里面就能获得数以万计的个体。除上述线虫外，模式生物秀丽隐杆线虫的突变体通常也保存在液氮中，冷冻与复苏属于再平常不过的常规操作，只是保存的时间相对此次报道要短很多。因此，自然界中能经受冷冻与复活的线虫太多了，并不是一件稀奇的事。

挪威冻土中分离到的盆咽线虫未知种

线虫不是唯一可以冷冻复活的动物

在2021年，俄罗斯科学院的Shmakova等人在西伯利亚永久冻土中发现了距今2.4万年前的蛭形轮虫（Bdelloid rotifers）,并成功的对其进行了复活（Shmakova et al., 2021, Current Biology）。蛭形轮虫是一种很小的多细胞动物，体长通常在0.1~1毫米之间，尺寸与线虫相近，通常需要用显微镜才能看清它们。除了能够耐受冷冻外，蛭形轮虫能够在干燥、冰冻、饥饿和低氧环境中长期生存，是一种研究极端生命的重要模型。研究发现，它可以抵御缓慢冷冻过程中冰晶形成的破坏，解冻后具有很强的细胞修复能力，并可在复活后通过孤雌生殖的方法自行繁殖。

蛭形轮虫形态（图片来源：Shmakova et al., 2021, Current Biology）

水熊虫的一类小型动物，属于缓步动物门（Tardigrata），主要生活在淡水的沉渣、潮湿土壤以及苔藓植物的水膜中，少数种类生活在海水的潮间带，有记录的大约有1000余种。缓步动物门具有全部四种隐生（Cryptobiosis）性，即低湿隐生（Anhydrobiosis）、低温隐生（Cryobiosis）、变渗隐生（Osmobiosis）及缺氧隐生（Anoxybiosis），能够在恶劣环境下停止所有新陈代谢。缓步动物也因此被认为是生命力最强的动物。在隐生的情况下，一般可以在高温（151 ℃）、接近绝对零度（-272 ℃）、高辐射（达到人类致死量 1000倍的X射线）、真空或6000 大气压下隐生的环境下生存数分钟至数日不等。缓步动物也是第一种已知可以在太空中生存的动物，被人类带入太快从事相关试验。

电子显微镜下的水熊（图片来源：https://www.britannica.com/）

从线虫到宏观动物，人类冷冻是否可能？

人体复活技术是个非常未来的概念，人体复活也只存在于科幻作品中，将身体机能降低至深度停滞状态，停止衰老，需要时再进行唤醒。人体复活在医学界具有重要的意义，即该技术可将重病或已无生命体征的身体冷冻起来，当未来科学进步时再复活进行医治。据资料显示，美国加州大学心理学教授詹姆斯·贝德福德 （James Bedford）是全球第一个冷冻人，他于1967 年死于肾癌后被冻存了起来，现在仍在美国的冷冻保存。冷冻宏观动物最大的技术挑战就是如何避免结冰过程中冰晶刺破细胞膜导致细胞死亡。因此，避免冰晶形成是目前冷冻技术研究的主要方向。目前，冷冻主要有两种方式，即慢速降温法与玻璃化冻存。慢速降温法主要是通过控制细胞或组织的冷冻速率，使细胞内的水逐渐脱离细胞，以减少细胞内冰晶的形成。玻璃化技术于上世纪八十年代提出，其原理是让高浓度的冷冻保护剂（二甲基亚砜、1,2-丙二醇、乙二醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖醇等）在超低温环境下凝固，这样一来就可以形成不规则的玻璃化样本。由于目前使用较广泛冷冻保护剂往往具有一定的细胞毒性，易造成细胞功能损伤，因此其应用范围非常有限。

此次科雷马盆咽线虫发现或许可以为冷冻人类提供一个新的思路，即研细胞如何减少和修复冰晶损害，而不是避免冰晶形成。以该线虫为模式生物，研究自然冷冻过程中该线虫细胞如何减少冰晶伤害，并在复苏时进行修复，阐明该过程的分子机理以及调控基因。当这一系列分子机理清楚，同时基因编辑操作技术与伦理方案成熟，宏观动物的冷冻就有机会实现。