A Flow Cytometry-Based Ultrahigh-Throughput Screening Method for Directed Evolution of Oxidases

一种基于流式细胞术的氧化酶定向进化超高通量筛选方法

来源：ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION

IF：16.823

摘要：氧化酶是化学和制药工业的研究热点，因为它们催化高度选择性的氧化反应。然而，自然界中发现的氧化酶通常需要重新设计以用于合成应用。在这里，我们开发了一个基于流式细胞术的通用和强大的筛选平台“FlOxi”，用于定向氧化酶进化。FlOxi利用在大肠杆菌中表达的氧化酶产生的过氧化氢将Fe2+氧化为Fe3+(Fenton反应)。Fe3+介导了His6标记的绿色荧光蛋白(EGFPHis)在大肠杆菌细胞表面的固定，确保了用流式细胞术鉴定有益的氧化酶变体。FlOxi被两种氧化酶--半乳糖氧化酶(GalOx)和D-氨基酸氧化酶(D-Aao)证实，产生了GalOx变异体(T521A)和D-Aao变异体(L86M/G14/A48/T205)，其中GalOx变异体(T521A)的Km值比野生型低4.4倍，而D-Aao变异体(L86M/G14/A48/T205)的kcat比它们的野生型高4.2倍。因此，FlOxi可用于产生过氧化氢的氧化酶的进化，并应用于非荧光底物。