《AHM》：预应力生物3D打印直接构建定向组织

体内如骨骼肌、肌腱、韧带和心脏组织是高度有序的组织结构，定向性的结构赋予了该类组织优异的力学及生物学性能，那能否在打印时就直接构建出定向组织结构？

EFL团队与浙大王平教授合作，提出了一种在打印时施加静态持续应力诱导细胞定向排布的预应力生物3D打印方法，能直接打印出具有持续力学刺激，细胞定向排布的多层组织结构，可通过调控力学刺激幅度以构造不同的生理组织结构。相关工作“3D Pre-stress Bioprinting of Directed Tissues”发表于《Advanced Healthcare Materials》。浙江大学机械工程学院贺永教授，浙江大学生物医学工程与仪器科学学院王平教授为该论文的通讯作者，李元戎及吴建国博士生为共同一作。

常规的挤出式生物3D打印方法，将生物墨水装入打印喷头挤出形成凝胶丝，喷头层层有序移动构建三维组织结构。然而这样的打印方式所构建的细胞排布是无序的，不适合有序组织的构建。

大家都知道挤出打印时会产生剪切力，过大的剪切力还有可能损伤细胞的活性。能否用挤出过程中合适的剪切力来诱导细胞定向呢？可惜的是打印的剪切力不能持续时间太长，不足以让细胞感应到能够产生定向的刺激。如果能想办法把打印过程中的力固定下来，形成预应力，那预应力就能调控细胞顺应力的方向生长了。

为此，经过了很长时间的探索，我们提出了预应力生物3D打印的新方法，在挤出打印时改变几个步骤，将打印出来的丝多一次拉伸，然后将拉伸后的丝固定下来，保持一个应力状态，如此反复打印出组织结构。由于这种方式使得打印的丝内存在持续静态预应力，能有效的刺激细胞功能化并且诱导细胞定向排布。                 

图一：3D预应力生物打印方法诱导细胞定向排布

我们以明胶，谷氨酰胺转氨酶和成纤维细胞作为生物墨水，从细胞活性，拉伸性能和凝胶丝之间的粘附力三个角度出发，寻找到该生物墨水的最佳打印温度为25℃，最佳打印时间窗口在25-32分钟之间。

图二：生物墨水打印参数优化

接着我们探究了细胞定向机理。有趣的是，我们发现使用３Ｄ预应力生物打印方法同样可以使明胶分子链产生定向排布效果。这是因为该生物墨水具有慢交联的特性，而我们在生物墨水半交联程度下进行打印。此时还有许多明胶分子链没有形成连接，在预应力打印拉伸后明胶分子链平行于拉伸方向排列。随后继续在谷氨酰胺转氨酶作用下连接，形成分子链定向排布的凝胶细丝。力学仿真数据表明，不同拉伸长度下凝胶丝内存在不同程度的应力。细胞在静态持续应力和明胶分子链定向排布的协同作用下实现各向异性结构。

图三：细胞定向排布机理

图四：３Ｄ预应力生物打印多种细胞类型图案化结构

目前，研究人员大多使用细胞定向结构修复人体定向组织（例如肌腱）。从组织修复的角度来看，与人体组织结构高度一致的人工组织结构具有更好的修复效果。但是，从组织再生角度思考，是否体外构建的组织需要和人体组织一样呢？于是，我们尝试通过预应力打印细胞定向结构修复非定向组织——皮肤。结果发现，具有定向结构的打印皮肤具有最佳的修复效果。我们进一步探究了其机制，成纤维细胞在３Ｄ预应力生物打印的凝胶丝中的持续静态应力刺激作用下增强了VEGF的表达，这作用于内皮细胞上的VEGF受体，进而促进血管新生并促进创面愈合。

图五：3Ｄ预应力生物打印皮肤组织的伤口愈合效果图六：免疫小鼠肉芽组织特征

全文地址：https://doi.org/10.1002/adhm.202301487