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什么是 miRNA?
miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ 转录,生成较长的前体 pri-miRNA,然后与辅助因子 DGCR8 一起被核糖核酸酶 Drosha 切割,从而产生一个发夹状的 pre-miRNA。随后,在 Exportin 5-RNA•GTP 复合体介导下,pre-miRNA 从细胞核转移至细胞质中,并在细胞质中被核酸酶 Dicer 切割掉末端的茎环结构,形成一个成熟的 miRNA 双链。成熟的 miRNA 被装载到Argonaute(AGO) 蛋白上,结合形成 miRNA-诱导沉默复合物 (miRNA-inducing silencing complex,miRISC),AGO 蛋白会对 miRNA 两条链进行选择,5’端热稳定性较低的 miRNA 引导链 (miRNA guide strand) 优先被保留,另一条乘客链 (miRNA pass) 则被降解。
左右滑动
图 2. 癌症和其他疾病中的 miRNA[3]
miRNA 诱导基因沉默
■ 策略一:miRNA 模拟物补充 miRNA
a. miRNA mimics 的两种结合模式:完全互补的 miRNA 与 AGO2 相互作用 (左);部分种子匹配的 miRNA 与 AGO1、3、4 相互作用 (右);miRNA 模拟物引导链 (红色), 乘客链 (紫色); 内源性 miRNA 引导链 (蓝色) 和乘客链 (橙色); b. 结合模式导向的靶识别导致靶切割或翻译抑制和 mRNA 衰变。
■ 策略二:阻断 miRNA 功能
miRNA 阻断剂与 mRNA 的某些特异性结合位点结合,通过占据结合位点来阻断正常 miRNA 与靶基因 mRNA 的结合, 但这些 “阻断剂” 不影响 miRNA 与其他不具有该特异性结合位点的靶基因结合[7]。
miRNA 海绵通常需要通过病毒载体转染然后才能转录出来。并且 miRNA 海绵同时含有众多 miRNA 结合位点,可以吸引目标 miRNA 与之配对结合,可作为 miRNA 结合的竞争性抑制剂[7]。
miRNA 抑制剂或 miRNA 海绵可隔离 miRNA 并降低其用于 miRISC 装载的可用性; 靶位点阻断剂阻断 miRNA 与特定靶 mRNA 的结合位点, 导致 mRNA 特异性抑制 miRNA 效应。
■ 实例:miRNA-29b 模拟物抑制肿瘤生长
a-b:用 Bim 特异性抗体 Western blot 分析 (a) PC3 细胞的细胞裂解液和 (b) 用 mimic miR-29b 处理的异种移植瘤;c:PC3 细胞转染对照或模拟 miR-29b, 在 0、24、48、72 h, 用台盼蓝染色细胞,用血细胞计计数活细胞数量。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示;d: 用 Calcein AM (绿色为活细胞)和 Ethidium homodimer-1 (红色为死细胞) 染色对照或转染miR-29b 的 PC3 细胞, 通过荧光显微镜定量活细胞和死细胞。箭头表示死亡细胞。右图显示死亡细胞的定量,由五个随机区域计算; e: 对照和实验小鼠的代表性肿瘤; f: 每周监测 2 次肿瘤体积,以平均值表示。
■ 小结
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参考文献
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