什么是坏死性凋亡

细胞死亡可分为两种模式：调节性细胞死亡 (RCD) 和意外细胞死亡 (ACD)。具有代表性的 RCD 是细胞凋亡，细胞凋亡 (apoptosis) 是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡 (见推文: 细胞凋亡——如何检测？速戳!)，相反，非生理刺激，如物理、机械和化学应力等外界因素诱导的被动和非程序性的坏死 (necrosis) 是 ACD 的代表。 

坏死性凋亡 (necroptosis) 综合了两者 (坏死和凋亡) 的特点，期间，可以观察到细胞器肿胀、细胞膜破裂，细胞质和细胞核的分解等形态学变化，是一种受到调控的细胞坏死过程，又被称为程序性坏死。

坏死性凋亡的分子机制

不同于凋亡过程，坏死性凋亡的调控过程不依赖于 Caspase 活性，其基本分子机制由两种受体相互作用蛋白激酶 (RIPK1 和 RIPK3) 和混合谱系激酶结构域样假激酶 (MLKL) 组成。RIPK3 调控 MLKL 磷酸化，诱导其寡聚化，易位至质膜并在质膜上产生孔复合体，导致 DAMPs (damage associated molecular patterns) 的分泌、细胞肿胀和膜破裂。

图 1. 坏死性凋亡机制图^[1]

坏死性凋亡与抗肿瘤免疫

研究认为：肿瘤细胞发生坏死是为其增殖和转移创造有利环境的自我牺牲策略，但坏死性凋亡在大多数情况下发挥肿瘤抑制作用。2016 年，Aaes 等人首次确认肿瘤中的坏死性凋亡是一种免疫原性细胞死亡。在 Vaccination with Necroptotic Cancer Cells Induces Efficient Anti-tumor Immunity 一文中，Aaes 等人将发生坏死性凋亡的肿瘤细胞制成预防性疫苗提前注射给小鼠，发现预防性疫苗的预处理抑制了小鼠的肿瘤生长，这表明发生坏死性凋亡的肿瘤细胞本身具有免疫原性，可刺激适应性免疫系统。Aaes 等人还指出，发生坏死性凋亡的肿瘤细胞可诱导树突状细胞的成熟、细胞毒性 T 细胞的交叉启动以及 IFN-γ 的产生。

2021 年 8 月 21 日，来自韩国的 You-Sun Kim 团队，在 Molecular Cancer 上发表了题为 RIPK3 activation induces TRIM28 derepression in cancer cells and enhances the anti-tumor microenvironment 的研究性论文，研究人员采用 TAP-MS 方法，结合 RNA 测序 (RNA-Seq) 数据集分析，确定了 TRIM28 是在坏死性凋亡过程中调节转录活性的共抑制因子。活化的 RIPK3 磷酸化 TRIM28，抑制TRIM28 的染色质结合活性，从而促进 NF-κB 和其他转录因子 (如 SOX9) 的反式激活。这些最终导致细胞因子表达升高，然后增强免疫调节过程，例如树突状细胞成熟等。总之，RIPK3 的表达与各种肿瘤类型的肿瘤浸润性免疫细胞群呈显著正相关，从而激活抗肿瘤免疫反应。

图 2. RIPK3/TRIM28 激活介导免疫刺激细胞因子的产生^[2]

2022 年 5 月 25 日，肿瘤免疫领域又有了关于坏死性凋亡的新发现。在 Nature 杂志发表的题为 ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis 的论文中，研究指出，DNA 的右旋状态 (B-DNA)是生物体中存在的最常见的状态，在特殊情况下，B-DNA 翻转形成“畸形”的左旋状态，即 Z-DNA。ADAR1 (RNA 腺苷脱氨酶1) 和 ZBP1 (Z-DNA 结合蛋白) 都可特异性识别 Z-DNA 并与之结合。ADAR1 通过抑制免疫原性双链 RNA (dsRNA) 来阻断免疫检查点抑制剂 (ICB) 的作用，而 ZBP1 可驱动肿瘤细胞发生坏死性凋亡。

CBL0137 可触发细胞中左旋 Z-DNA 的形成，激活癌症相关成纤维细胞中的 ZBP1 依赖性坏死性凋亡途径。CBL0137 在癌症相关的成纤维细胞中诱导 ZBP1 依赖的坏死性凋亡，并且无论导致癌症的突变如何，CBL0137 都可杀死支持肿瘤生长的成纤维细胞，并在黑色素瘤的小鼠模型中逆转了 ICB 的无反应性。

图 3. CBL0137 诱导 ZBP1 依赖的坏死性凋亡^[4]

CBL0137 激活 ZBP1 依赖的细胞核坏死性凋亡：通过诱导 Z-DNA 累积进而触发了 ZBP1、RIPK3 和 MLKL 之间的反应。 

坏死性凋亡的检测方式

坏死性凋亡的检测，关键的挑战在于将它与凋亡和坏死区分开。很多情况下，凋亡、坏死、坏死性凋亡等不同的死亡方式会同时存在于细胞群中。因此，细胞死亡的检测要辅以实时的形态分析以及死亡通路的抑制或敲除。同时，找对采样的时间点也很关键。

■ 形态变化

细胞死亡的形态变化是一个动态变化的过程，因此，需要实时“监控”整个过程才能确认坏死性凋亡的发生。延时视频显微镜能够将单个细胞的形态变化与分子、亚细胞和生化事件相关联，从而检测坏死性凋亡 (但此方法成本较高且比较耗费人力)。

■ 抑制和敲除

坏死性凋亡的抑制剂——RIPK1 抑制剂 Necrostatin-1 和 MLKL 抑制剂 Necrosulfonamide 来阻断坏死性凋亡，测定细胞的存活率，反向验证坏死性凋亡的发生。但是抑制剂能在某些细胞中诱导细胞凋亡，在区分坏死性凋亡和凋亡方面不够特异。因此，需要通过敲除关键蛋白 (如 RIPK3 或 MLKL 阻断坏死性凋亡)，补充抑制实验的证据。

■ 关键蛋白质检测

用 Western blot、免疫组化或流式细胞仪来检测坏死性凋亡途径中的关键蛋白质如 RIPK3、RIPK1 和 MLKL 的变化。磷酸化 MLKL (Ser358 和 Thr357) 是最常见的检测蛋白，可确认坏死性凋亡是通过 RIPK3 介导的 MLKL 激活。此外，高比例的 RIPK1/ pro-caspase-8 的高比例也说明了环境有利于坏死性凋亡。

图 4. 细胞死亡检测一般流程^[5]

■ 关键蛋白质检测

在癌症中，坏死性凋亡主要发生在晚期肿瘤的中心，坏死细胞分散。在不通过显微解剖富集的情况下，很难检测到关键蛋白标记物。Baik 等人在 Examining MLKL phosphorylation to detect necroptosis in murine mammary tumors 一文提供了一种详细的免疫组织化学导向的方法，包括从小鼠乳腺肿瘤模型中分离肿瘤、通过 H＆E 染色识别坏死区域以及检测磷酸化 MLKL 来检测坏死性凋亡；该方法也可用于其它类型的实体瘤。

图 5. 检测小鼠肿瘤组织的坏死性凋亡^[6]

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参考文献

1. Galluzzi L, Kepp O, Chan FK, Kroemer G. Necroptosis: Mechanisms and Relevance to Disease. Annu Rev Pathol. 2017 Jan 24;12:103-130.

2. Aaes TL, Kaczmarek A, Delvaeye T, et al. Vaccination with Necroptotic Cancer Cells Induces Efficient Anti-tumor Immunity. Cell Rep. 2016 Apr 12;15(2):274-87.

3. Park HH, Kim HR, Park SY, et al. RIPK3 activation induces TRIM28 derepression in cancer cells and enhances the anti-tumor microenvironment. Mol Cancer. 2021 Aug 21;20(1):107.
4. Zhang T, Yin C, Fedorov A, et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 2022 Jun;606(7914):594-602.
5. ‍‍‍‍‍‍‍‍‍Chapter · February 2014. Methods to Study and Distinguish Necroptosis. DOI: 10.1007/978-1-4614-8220-8_18

6. Baik JY, Wan P, Liu ZG. Examining MLKL phosphorylation to detect necroptosis in murine mammary tumors. STAR Protoc. 2022 Jun 14;3(3):101457.