蛋白磷酸化实验

    翻译后修饰（Protein post-translational modification，PTM）存在多种形式, 例如蛋白磷酸化,糖基化，泛素化等。蛋白质磷酸化是通过酶促反应将磷酸基团转移到蛋白特定氨基酸残基上的过程，在生物体内普遍存在 ,尤其在抗病育种中扮演重要的角色。

蛋白磷酸化两种情况

1>  蛋白是否具有磷酸化位点

首先利用软件 NetPhos-3.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）对该蛋白进行磷酸化位点预测，一般是真核生物蛋白中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸磷酸化位点。

2>  激酶蛋白磷酸化另一个蛋白

针对上述两种情况，可以利用磷酸化抗体和磷酸化标签进行研究

一、磷酸化抗体

原理：利用磷酸化抗体识别一个底物磷酸化位点，磷酸化主要集中在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸 残基上，这些残基上具有游离的羟基，且本身不带电荷，当磷酸化后蛋白质便具有了电荷，从而使结构发生变化，进一步引起蛋白质活性的变化。

二、磷酸化标签（Phos-tag）

2002年，广岛大学的小池教授及其团队发表了一个双环金属络合物（1,3-bis[bis（pyridin-2-ylmethyl）amino]propan-2- olato dizinc（II） complex） 在中性条件下作可选择性结合磷酸化标签分子，即Phos-tagTM。后续出现很多衍生产品。

Phos-tagTM 系列S是特异性结合磷酸化离子的一种功能性分子，具有以下特点：

1.与磷酸离子（^2-）的选择性结合能力强于其他阴离子

2.在生理条件下（PH5-8）形成稳定的化合物

原理：该方法只需要在常规的SDS-PAGE胶中添加Phos-tag，根据迁移率不同，能够区分磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白。

三、磷酸化蛋白检测方法

1． westernblot （常用方法）

2 酶联免疫吸附分析（ELISA）

3 磷酸化特异抗体开发

4 激酶活性分析

5 细胞内流式细胞术和CC/IHC

6 质谱

参考：蛋白质磷酸化及其检测方法简介

             蛋白磷酸化鉴定技术介绍