三维拓扑微环境调控功能化肌腱再生

137 Sandwich Biomimetic Scaffold Based Tendon Stem_Progenitor Cell Alignment in .pdf

肌腱损伤是骨科常见疾病，在所有肌肉骨骼相关疾病中，占比约为30%，严重影响患者的生活和工作。可惜由于肌腱组织的再生能力较差，其治疗仍然是一项艰巨的挑战，其明确而又复杂的微结构仍然是肌腱组织工程的难题。为了模拟肌腱固有的胶原纤维排列，具有表面微观图案化结构的生物材料是肌腱组织工程的首选。

然而，大多数研究细胞定向研究仅限于二维（2D）培养，这与体内三维环境不同，三维环境在体外通常使用水凝胶的包裹来模拟体内环境，那么，三维环境下细胞对拓扑结构如何响应呢？三维环境也是对细胞生长扩散的一个物理限制，三维微环境下拓扑结构还能诱导细胞定向吗？肌腱干细胞处在有拓扑结构的三维微环境下对肌腱的再生修复有何影响？

针对这两个问题，我们先使用高精度3D打印技术制造了带有表面平行纹路的GelMA水凝胶支架，对接种其表面的肌腱干细胞再次使用水凝胶包裹构成一种类似三明治结构（sandwich）的体外三维培养模型来研究细胞的反应。相关研究“A Sandwich Biomimetic Scaffold Based Tendon Stem/Progenitor Cells Alignment in 3D Micro-environment for Functional Tendon Regeneration” 近期发表在ACS Applied Materials & Interfaces期刊上，浙江大学浙二医院骨科李思浩医生为第一作者，浙江大学机械工程学院贺永教授、浙江大学浙二医院骨科严世贵教授和浙江大学浙二医院骨科颜瑞健医生为共同通信作者。

首先，我们通过高精度3D打印制造出带有表面平行纹路的水凝胶支架，平行纹路的平均宽度 7.11±2.14 μm，高度 9.52±1.98 μm，其尺寸与天然腱体组织相近。随后我们进行了表面纹路GelMA水凝胶支架以及不同时间接触引导后构建sandwich模型对 TSPCs 形态的影响。结果显示第一组细胞（粘附时间 1 h）开始时呈圆形，缓慢扩张以对抗 ECM 外部限制。迁移细胞表面伸出丝状伪足。部分 TSPCs 沿特定的沟槽方向排列，有些则垂直于槽。对于第二组，3 h的粘附使细胞有更多的时间完成线性变形，更多的细胞按照基板的凹槽图案排列。在黏附6 h的第三组中，大多数细胞倾向于沿特定的沟槽方向排列。细胞种在沟槽基底上的3D环境条件倾向于沿着特定的方向排列。这种特异性取向是根据细胞植入基质的初始形态优先确定的。

为了深入研究3D环境对平行TSPCs的作用，我们使用 SMART-Seq 对2D随机组（2DR组）、2D平行组（2DA组）、3D环境随机组（3DR组）和 3D 环境平行组（3DA组）的细胞进行了比较。肌腱相关基因，如 TNMD、ECM1、ASPN、FN-1、COL14A1、GHR 在 3DA 组中较 2DA 组明显上调。然后3DR和2DR组之间的结果表明，与2DR组相比，3DA组中发现的显著上调的肌腱相关基因（包括TNMD、ECM1、ASPN、FN-1、COL14A1和GHR）在3DR组中没有显著上调，这表明3D微环境单独不具有强烈的肌腱分化效应。此外2DA组和3DA组之间的差异在于与炎症相关基因，在2DA组中显著增高。

然后采用 qRT-PCR 检测 8 个肌腱相关基因的表达水平和炎症相关基因，证实了 3D 环境对炎症相关基因的影响。通过 Bio-Plex 大鼠细胞因子阵列进一步验证了 TSPCs 产生细胞因子的能力，其中 7 种细胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、G-CSF/CSF3、GRO/KC/CXCL1、MCP-1α/CCL3、MIP-3α/CCL20）在 2DA 组和 3DA 组间有显著差异，另外 5 种细胞因子（IL-17A、IL-18、G-CSF、GM-CSF/CSF2、MCP-1/CCL2 和 VEGF）在两组间无显著差异。2DA 组中促炎细胞因子 IL-1α、IL-1β、IL-6 浓度均高于 3DA 组。2DA 组中趋化因子 G-CSF/CSF3、GRO/KC/CXCL1、MCP-1α/CCL3、MIP-3α/CCL20水平也均高于 3DA 组。我们的结果表明，3D 环境可以显著降低 TSPCs 的炎症表型。

我们的研究数据表明，3D 环境下平行沟槽拓扑结构有利于 TSPCs 的腱性分化和炎症表型的减少。因此，三维定向 TSPCs 复合水凝胶支架材料可能有助于肌腱缺损的修复。我们使用载有三维微环境定向 TSPCs 的支架（S-TSPCs），在体外进行三维环境平行排列培养，使其功能化，再将三维排列的 TSPCs 复合材料植入大鼠肌腱缺损进行原位修复。

经过术后 8 周时间的愈合与重建，各组呈现出不同程度成熟，可见 S 与 S-TSPCs 组炎症细胞浸润逐渐减少，炎症明显消退。与 S 组相比，S-TSPCs 组获得了更令人满意的再生结果，展现出的 ECM 沉积更有序，类似于天然肌腱。

我们通过透射电子显微镜（TEM）研究了新肌腱的超微观结构，纵、横截面结果列 I 和列 II 所示。在纳米尺度上，S-TSPCs 组术后 4 和 8 周的纤维生成过程中形成了更成熟的排列整齐的胶原纤维。特别地，S-TSPCs 在两个时间点都产生了更多成熟的胶原原纤维。术后4 周，S 组原纤直径以<100 nm 为主，而 S-TSPCs 组原纤维的直径在 100-200 nm 居多。在术后 8 周，S-TSPCs 组中成熟纤维占主导，而支架组中仅检测到较少的纤维。对照组主要由无序的小的胶原原纤维组成。

大鼠的跟腱受损也产生了一个明显的行走步态障碍，使其脚印形态发生明显的变化。因此，我们采集了各组不同时间点的脚印，计算出相应地 AFI 值，如图所示，跟腱受伤大鼠的后爪印在受伤一侧明显变长变窄，正常组则为较短较宽的爪印。术后第 2 周，大鼠手术侧的后肢脚印变得比正常侧更细长；而术 4周，各组均有较大程度的恢复；随着修复时间的延长，各组的后肢脚印逐渐有着不同程度地恢复，甚至接近于正常形态。术后第 2 周，与对照组和 S 组相比，S-TSPCs组术后 2 周恢复较快。此外，在修复过程中，力学性能也是肌腱恢复功能的最重要的指标。S-TSPCs产生再生肌腱的弹性模量高于 S 组支架单独处理。

综上，本研究发现，3D排列的TSPC可以通过PI3K/AKT途径增强基质拓扑诱导的肌腱分化，并改善其炎症表型。细胞周围的维度在控制时空细胞行为和功能方面起着重要作用。此外，在大鼠跟腱缺损模型中，3D对齐的TSPC复合物可以促进肌腱再生。因此，三维排列的TSPC复合材料具有巨大的临床应用潜力。

全文链接：https://doi.org/10.1021/acsami.2c16584