首先，帮大家区分一下几个生物实验中飘来飘去的“象形”词——PCR、qPCR、逆转录/反转录……

PCR (Polymerase Chain Reaction)：聚合酶链式反应，基于碱基互补配对原则放大扩增特定 DNA 片段的分子生物学技术，即将微量的 DNA 指数增加。

qPCR (Quantitative Real-time PCR)：实时荧光定量 PCR，一般是 real-time PCR 的简称。指在 PCR 反应中，通过荧光化学物质检测 PCR 循环后的产物总量，反应中需通过内参或外参对特定 DNA 进行定量分析。后续可通过扩增曲线 (Amplification curve) 和熔解曲线分析 (Dissociation curve) 定量结果。

逆转录或反转录 (Reverse transcription)：是指以 RNA 为模板，在逆转录酶的作用下，合成 cDNA 的过程，通常所提及的 RT-PCR 或 RT-qPCR 词中的 RT 便是此意。后续便可以此 cDNA 为模板进行 PCR 或 qPCR 实验。

RNA-cDNA-qPCR，是做定量的一个常见实验流程，即先从目标样本中提取 RNA，通过逆转录酶进行逆转录得到单链 cDNA，并以此为模板进行 qPCR，大都为验证某个基因的相对表达量，那如何让这个过程 “丝丝滑滑” 呢？

(得嘞，RNA，娇贵娇贵！包容包容！我懂我懂！)

■ 完整度评估

mRNA 约占总 RNA 的 3%，rRNA 约占总 RNA 的 80% 以上。一般可通过凝胶电泳对 RNA (主要是 rRNA) 的完整性进行评估。那如何通过 RNA 的胶图分析这各种污染 “Bug” 呢？

以真核生物举例：完整的总 RNA 电泳后会产生 28S、18S、5.8S 的 rRNA 条带，28S 与 18S 的条带强度大致比例应为 2:1 (图 3a)。电泳条带 5.8S rRNA 出现则表示有轻微降解。RNA 本身就 “矫情”，得 “富养”~，因此在一般实验中，5.8S 条带出现很正常，但如果只有这一种条带且有明显弥散现象 (图 3b)，后续逆转录的话还是建议 “及时止损” 吧！

若在 28S 以上出现多余的条带，还贼亮，gDNA 污染，无疑了 (图 3b)！若在点样孔中还有明亮亮的 “钉子户”，大概率的蛋白污染，可以“定罪了”。

真核生物胶图的目的条带为 23S、16S 和 5S，质检方法参照以上即可。

(如果你跑的胶明显的干干净净、“不染世俗”，小可怜，RNA 提取，再来一遍吧！)

还是以真核生物举例：RNA 逆转录为 cDNA，看似简单，实则 “心潮澎湃”，屡战屡败的实验汪们已经小心到呼吸频率都降低了，但各种问题还是奇奇怪怪，而且跨完 “此坑” 又见 “彼坑”。

图 3. 标准扩增曲线 (a) 和溶解曲线 (b)

天青色等烟雨，而我在等你，关于 qPCR 的一些 “纷纷扰扰”，你且听我细细说。