大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原体，前者可引起强烈的免疫炎症反应而促进自愈，后者则通常缺乏炎症反应。目前对金葡菌抑制免疫反应的机制研究尚且不足。近期，浙江大学动物病理实验室谭勋老师团队在 Cells 期刊发表了题为“大肠杆菌和金葡菌差异调控 Nrf2 通路导致牛乳腺上皮细胞发生不同免疫炎症反应”的文章。研究团队采用转录组学分析后发现，大肠杆菌和金葡菌差异调控 Nrf2 下游调控基因表达，与大肠杆菌不同，金葡菌缺乏激活 Nrf2 的能力。进一步研究表明，Nrf2 信号通路决定了病原特异性免疫反应。与在其他细胞中的发现不同，Nrf2 正向调控奶牛乳腺上皮细胞应对病原体的免疫反应。本研究发现金葡菌可抑制 p62 介导的非经典 Nrf2 信号通路活化，揭示了金葡菌抑制乳腺组织发生免疫炎症反应的原因，为防控金葡菌性乳腺炎提供了新的靶点。

研究方案

本项研究分离培养了原代奶牛乳腺上皮细胞 (bMECs)，分别用灭活的大肠杆菌和金葡菌刺激后进行转录组测序分析，发现大肠杆菌可诱导多条炎症信号通路活化，但金葡菌差异调控的基因与炎症反应无关。进一步分析发现，大肠杆菌可诱导多条 Nrf2 (Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2) 下游基因转录，而金葡菌对 Nrf2 下游基因的表达无显著影响。在此发现的基础上，作者探究了 Nrf2 对免疫炎症反应的调控作用，并探讨了金葡菌阻断 Nrf2 通路活化，进而抑制免疫炎症反应的机制。

图 1. 研究方案示意图。

研究过程及结果

• 转录组学揭示大肠杆菌和金葡菌差异调控免疫反应及 Nrf2 下游基因表达

对差异表达基因进行基因功能分类 (Gene Ontology, GO) 功能富集和 KEGG Pathway 分析发现，在大肠杆菌刺激的细胞内，引起的上调基因主要富集于先天免疫反应通路，包括了 NF-κB、Toll 样受体、NOD 样受体等，下调基因主要与细胞增殖、细胞死亡和代谢过程有关。但是在金葡菌刺激的细胞中，只检测到 16 条差异表达基因。由于差异表达基因过少，无法进行 GO 功能富集分析。对转录组学结果进一步分析发现，大肠杆菌可引起 Nrf2 下游多条基因表达上调，而金葡菌不能引起 Nrf2 下游基因改变。

图 2. 大肠杆菌上调基因的功能注释和通路分析。

• 大肠杆菌和金葡菌差异调控 Nrf2 通路

为了进一步验证大肠杆菌和金葡菌差异调控 Nrf2 通路，作者观察了两种病原刺激下 Nrf2 的入核情况。发现大肠杆菌和 LPS 均可引起 Nrf2 通路活化，相反，金葡菌无法活化 Nrf2 通路。

图 3. 金葡菌抑制 Nrf2 活化。

• Nrf2 调控乳腺上皮细胞的免疫反应

作者利用 LPS 刺激的炎症细胞模型，观察敲低 Nrf2 对炎症反应的影响。发现敲低 Nrf2 后，LPS (Lipopolysaccharides) 诱导的炎性细胞因子转录和 NF-κB 通路均受到显著抑制，提示 Nrf2 正调控乳腺上皮细胞的免疫炎症反应。随后，作者构建了带有入核序列的 Nrf2 过表达质粒 (3xNLS-Nrf2) 并转染乳腺上皮细胞，发现激活 Nrf2 后金葡菌诱导的致炎因子表达显著上调，这一结果反向证明，金葡菌无法诱导强烈的的免疫反应与 Nrf2 活化不足有关。

图 4. Nrf2 对 LPS 和金葡菌诱导的免疫反应的影响。

• 金葡菌损伤非经典 Nrf2 通路抑制其活化

已知氧化应激可激活 Keap1-Nrf2 信号通路 (经典通路)。作者发现，金葡菌抑制 Nrf2 活化并不是因为活性氧 (ROS) 生成不足而造成的。除了经典通路外，Nrf2 活化还受 p62/SQSTM1 非经典通路调控，作者检测了两种病原感染后 p62/SQSTM1 的蛋白表达水平和磷酸化水平，发现金葡菌抑制 p62/SQSTM1 在丝氨酸 349 位点的磷酸化，相反，大肠杆菌和 LPS 可促进 p62 磷酸化。以上结果表明金葡菌可阻止 p62/SQSTM1 依赖的 Keap1 降解，从而阻断非经典 Nrf2 通路活化。

图 5. 大肠杆菌和金葡菌差异调控 Keap1 降解和 p62/SQSTM1 磷酸化。

研究总结

综上，本研究发现 Nrf2 介导的免疫炎症反应具有病原特异性。与大肠杆菌不同，金葡菌可抑制 Nrf2 活化，这可能是金葡菌性乳腺炎缺乏强烈免疫反应的重要原因。作者发现 Nrf2 具有促炎作用，这与在其他物种中发现 Nrf2 具有抗炎作用不同，这种差异是否与动物种属有关还有待进一步研究。

原文出自 Cells 期刊

Ying, Y.-T.; Yang, J.; Tan, X.; Liu, R.; Zhuang, Y.; Xu, J.-X.; Ren, W.-J. Escherichia coli and Staphylococcus aureus Differentially Regulate Nrf2 Pathway in Bovine Mammary Epithelial Cells: Relation to Distinct Innate Immune Response. Cells 2021, 10, 3426.

Cells 期刊介绍

主编：Cord Brakebusch, The University of Copenhagen, Denmark 

Alexander E. Kalyuzhny, Neuroscience, USA

期刊涵盖细胞生物学、分子生物学和生物物理学等方面的研究。目前已被 SCIE (Web of Science)、PubMed、MEDLINE、PMC 等数据库收录。

2021 Impact Factor：7.666

2021 CiteScore：6.7

Time to First Decision：16 Days

Time to Publication：39 Days