代谢学人

Cell Metabolism: T-bet⁺ B细胞：肥胖真凶。真相只有一个！

校对 | 刘爽

背景介绍

       近年来，肥胖会引起脂肪组织的慢性炎症，导致糖耐量受损和2型糖尿病（T2D）。包括巨噬细胞和淋巴细胞在内的脂肪免疫细胞在一定程度上维持体内代谢稳态，在调节代谢紊乱方面发挥关键作用。

       为了探究B淋巴细胞对饮食诱导的肥胖起到有益还是有害的作用，本文的课题组在先前的研究中分析了肥胖期间的慢性炎症是否优先激活特定的B细胞亚群。结果发现由感染或自身免疫性疾病引起的慢性炎症使得表达CD11c和T-bet的B细胞增多。表达T-bet的脾脏B细胞也在早期自身免疫环境建立中积累，并受到细胞因子IFNγ和IL-21，TLR7、TLR9以及B细胞受体(BCR)的正向调控。在衰老和肥胖过程中发现的T-bet⁺ B细胞是缺乏CD21和CD23的B细胞（双阴性B细胞），先前被描述为是一种与年龄相关的B细胞(ABCs)（小编注：年龄相关B细胞（ABC）是一类随着年龄增长而扩增的B细胞亚群，自从2011年首次在小鼠中被发现可能是自身免疫疾病的潜在驱动因素后，ABC受到了越来越多的关注。ABC表达经典的小鼠B细胞标记物（如B220、CD19和IgM）、髓样细胞的标记物（如CD11c）以及转录因子T-bet，并响应于IL-21而扩增。CD21和CD23双阴性B细胞主要是排除衰老和肥胖过程B细胞的增多不是由于淋巴瘤或淋巴异常导致的）。另一种淋巴细胞种群，恒定自然杀伤T细胞 (iNKT)，在瘦的人脂肪组织中富集，但在肥胖过程中逐渐耗尽。iNKT细胞根据免疫环境的不同负向或正向调节B细胞。iNKT细胞可以表达恒定的T细胞受体，并对病原体刺激的危险信号、抗原呈递的CD1d分子中的糖脂或同时对两者作出快速反应。iNKT细胞是一种重要的调节细胞，能够产生促炎和抗炎细胞因子，并表达IL-10，能够在一定程度上维持代谢稳态。在肥胖和T2D期间，脂肪组织中CD11c⁺炎性髓细胞、T调节细胞和iNKT细胞的变化已有很详尽的研究，但它们与脂肪B细胞的相互作用仍未确定。

       在近期发表在Cell Metabolism杂志上的一篇题为“T-bet⁺ B cells accumulate in adipose tissue and exacerbate metabolic disorder during obesity”的文章中，研究人员揭示了肥胖期间T-bet⁺ B细胞对代谢紊乱和糖尿病的作用。脂肪组织T-bet⁺ B细胞在体重指数(BMI)增加的人群和体重增加的小鼠中积累。在肥胖期间，受到TLR7或糖脂刺激后，作为一种具有独特表型的B细胞群体，T-bet⁺ B细胞可以通过iNKT细胞的激活而增加。与野生型小鼠相比，B细胞中T-bet的特异性敲除改善了高脂饮食(HFD)小鼠的葡萄糖耐量。反之，富含T-bet⁺ CD11c⁺的B细胞群移植加剧代谢紊乱并促进炎症反应。此外，T-bet⁺ B细胞会程序性驱动CXCL10 (一种已知的破坏胰腺β细胞介质) 的分泌。给予HFD后，B细胞中缺乏T-bet的小鼠体重增加较少，脂肪组织中巨噬细胞(尤其是M1巨噬细胞)积累也较少，移植对照HFD小鼠的血清或纯化的IgG会逆转这一现象。简而言之，T-bet⁺ B细胞通过包括分泌致病性IgG在内的多种效应加剧代谢性疾病的发展。这些发现为肥胖期间小鼠和人类代谢紊乱的病理生理学提供了深入的见解，并为未来肥胖、T2D和其他炎症疾病的免疫疗法的合理设计提供依据。

敲黑板啦！

研究结果

1.B细胞在超重和肥胖患者的脂肪组织中被激活

        由于人类脂肪组织中B细胞的亚群组成尚未被完全阐明。为了阐明脂肪组织中B细胞的特征，研究人员从塑形手术患者切除的腹部皮下脂肪组织中分离出人淋巴细胞(补充表1)，并对正常体重(对照组)(BMI＜25 kg/m²)、超重(BMI 25 - 30 kg/m²)和肥胖(BMI＞30 kg/m²)患者脂肪组织中提取的淋巴细胞进行分析(图1A)。结果显示，不同BMI患者人群中的B细胞的比例没有显著性差异。但与对照组相比，超重及肥胖患者体内的iNKT细胞比例显著降低，这与之前的报道一致(图1A)。研究人员进一步分析发现，肥胖患者的B细胞体积变大，且与BMI增加呈正相关关系(图1B)。但细胞大小与BMI的相关性并不是B细胞独有的，T细胞也显示出类似的细胞大小与BMI之间的相关性(辅图1A)。

      转录因子T-bet是T_H1谱系（T辅助细胞）的主要调节因子，也可以在慢性炎症中调节B细胞亚群的增加。考虑到超重和肥胖患者脂肪组织的慢性炎症状态，研究人员检测了脂肪组织B细胞中T-bet的表达。结果发现，超重或肥胖患者的B细胞内T-bet蛋白水平显著高于对照组，T-bet蛋白水平与BMI呈正相关关系(图1C)。接下来研究人员检测了淋巴细胞表面CD11c（粘附蛋白白细胞整合素integrin家族成员之一，是髓系细胞的表面marker）的表达，发现与对照组相比，超重患者B细胞中的CD11c表达量显著增加，肥胖患者增加不明显。表明B细胞中CD11c表达与BMI无相关性(图1D)。紧接着研究人员又检测了淋巴细胞早期激活标志物CD69的表达，发现CD69与CD11c表达模式类似，超重患者B细胞的CD69表达量显著高于对照组和肥胖患者组 (图1E)。来自同一患者的CD3⁺ T细胞的T-bet蛋白表达有上升的趋势但没有显著增加，因此上述观察到的T-bet、CD11c、CD69蛋白表达变化可能是脂肪组织B细胞所特有的(辅图1B-1D)。此前已有表达T- bet的B细胞在自身免疫和衰老时的相关研究，因此研究人员探究了年龄与脂肪B细胞激活标志物表达之间的潜在相关性。结果发现，年龄与脂肪B细胞或T细胞激活标志物的表达之间没有相关性(辅图1E-1H)。由此可见，BMI才是脂肪组织B淋巴细胞激活表型的主要决定因素。综上，BMI与B细胞活化和人类脂肪组织B细胞中T-bet的表达增加呈正相关。

       T-bet是调控1型辅助T细胞（Th1）的最重要的转录因子。后来，T-bet被发现也在先天免疫系统(innate immunity)和先天样淋巴细胞(innate-like adaptive lymphocytes)中起到关键作用。但是，几乎所有的研究都局限于T-bet基因敲除小鼠模型。T-bet在人体的作用大多是来自基于小鼠实验模型的数据的推断，却没有被在人体被直接研究过。

       Th 是免疫反应中重要的调控/效应细胞，可分为Th1 及Th2 型，正常情况下，其功能和数量处于平衡状态。Th1、Th2 是由共同的前体细胞Th0 分化而来，而转录因子T- bet 和GATA- 3 是特异性调控Th0 分化、调控Th1/Th2 转换作用的关键因子。从来自Th1 细胞系的PL17、OF6、AE7 以及来自Th2 细胞系的CD35、CD10的RNA 免疫印迹分析显示，T-bet 转录只出现于Th1 细胞系，因此，认为T- bet 选择性表达于Th1 细胞，且有组织特异性只限于肺、胸腺和脾脏，其表达水平通过T 细胞受体（TCR）介导的信号传导而增强。另有研究表明T- bet 除表达于CD4⁺ Th1 细胞和NK 细胞外，也可表达于非淋巴细胞，如树突状细胞（DC），巨噬细胞在IFN- γ 的诱导下也能表达T- bet，而且经IFN- γ 刺激后所表达的T- bet 水平明显高于NK 细胞所表达的T- bet。本文研究发现T-bet⁺ B细胞在肥胖人群或高脂喂养小鼠脂肪组织中积累，促进代谢紊乱的发生。

参考文献：

【1】Vanja Lazarevic, et al.Nat Rev Immunol. 2013 Nov;13(11):777-89.

图1 脂肪B细胞中T-bet、CD11c和CD69表达的增加与肥胖人群的BMI增加相关

补充表1 研究参与者的特征

辅图1 人T、B淋巴细胞蛋白表达与年龄和BMI的关系，与图1相关

2.肥胖诱导的T-bet⁺ B细胞在小鼠和人的脂肪组织积累是保守的

       接下来，研究人员探究了BMI与人类脂肪组织B细胞中T-bet表达之间的相关性是否与T-bet⁺ B细胞亚群的增加相关。结果显示，与对照组相比，超重和肥胖患者腹部皮下脂肪组织中B细胞中T-bet表达增加(图1F)，T-bet⁺ B细胞的比例显著升高(图1G)。且脂肪组织中T-bet⁺ B细胞比例与患者年龄无关(图1H)。然而，BMI与人体脂肪组织中T-bet⁺ B细胞的比例存在显著正相关(图1I)，表明BMI是影响肥胖过程中人类脂肪组织中T-bet⁺ B细胞积累的关键因素，而不是年龄。

       接下来，研究人员对来自同一患者脂肪组织的T-bet⁺ B细胞和T-bet^- B细胞进行了表型分析。结果发现，与自身T-bet^- B细胞相比，来自超重和肥胖患者的T-bet⁺ B细胞的CD11c表达水平明显更高，而且在对照组中也有类似的趋势(图1J)。由此可见，即使在瘦的人群中，T-bet⁺ B细胞也会表达CD11c。另外，来自超重和肥胖患者脂肪组织的T-bet⁺ B细胞与自身T-bet^- B细胞相比，细胞体积变大，淋巴细胞激活标记物CD69和Nur77表达增加，而对照组在B细胞蛋白质水平方面没有类似的变化(辅图2)。研究人员还注意到同一患者的T-bet⁺和T-bet^- B细胞的糖脂抗原呈递分子CD1c的表达水平无显著差异(辅图2)。然而，在肥胖患者中，T-bet⁺ B细胞表达的CD1d蛋白明显少于自身T-bet^- B细胞(图1K)。超重患者也表现出类似的趋势。已有文献报道T-bet⁺ B细胞表达的CD27水平低于记忆B细胞。研究人员发现与自身脂肪组织T-bet^- B细胞相比，T-bet⁺ B细胞表面CD27表达量略低，但没有统计学意义(辅图2)。因此，来自超重和肥胖患者的T-bet⁺ B细胞表现出活化B细胞的特征，包括CD11c、CD69和Nur77表达的上调（小编注：CD1c/CD1d可以呈递脂质或者糖脂抗原给T细胞，产生T细胞活化的辅助信号，CD27是一种CD4⁺和CD8⁺T细胞上表达的跨膜磷酸糖蛋白，在T细胞活化时表达增加，并从细胞表面脱落，活化后形成可溶性CD27，这三者表达量不发生变化说明T细胞未被活化）。

       由于T-bet⁺ B细胞在超重和肥胖患者的脂肪组织中积累，研究人员接下来利用小鼠模型进行体内实验，分析T-bet⁺ B细胞的功能及其在脂肪组织中积累的机制。为此，研究人员对C57BL/6野生型(WT)小鼠进行了8周的HFD喂养，诱导其肥胖、代谢紊乱和伴随的2型糖尿病（T2D）症状。结果显示，与正常饮食(NCD)的对照组小鼠相比，高脂饮食组(HFD)的小鼠体重增加明显，附睾白色脂肪组织(WAT)的重量也显著增加(图2A)，基础血清葡萄糖含量增加，葡萄糖耐量受损(图2B)。流式分析结果显示，HFD喂养的小鼠在WAT或脾脏中的总B细胞比例与对照组小鼠相比没有差异，这与人类超重和肥胖组织中的情况类似(图2C)。在NCD小鼠与HFD小鼠的WAT中，总B细胞的数量也没有差异，但与NCD小鼠相比，HFD小鼠脾脏中的总B细胞有非常微小的增加（图2C）。然而，与超重和肥胖的患者类似，相比于NCD小鼠，HFD喂养的肥胖小鼠附睾脂肪组织中T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞的比例和数量显著升高(图2D)，脾脏中有T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞积累现象(图2E)。与人类相似，脂肪组织和脾脏中T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞比例与体重显著相关(图2D、E)。

       接下来研究人员比较了来自同一小鼠的T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞和T-bet^- CD11c^- B细胞的表型。结果发现，HFD喂养的小鼠T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞显示出与肥胖或超重患者的T-bet⁺ B细胞相似的表型。与T-bet^- CD11c^- B细胞相比，其T-bet⁺ CD11c⁺B细胞的体积更大，CD69和细胞内Nur77的蛋白表达水平更高(图2F-2H)，而补体受体CD21和低亲和力IgE受体CD23的蛋白表达水平则较低(图2I和2J)。此外，HFD小鼠与NCD小鼠相比，脾脏其他B细胞亚群的比例没有显著差异(辅图3A和3B)。与肥胖患者相似，HFD小鼠T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞与自身T-bet^- CD11c^- B细胞相比，CD1d的表达水平明显降低，而NCD小鼠这两个B细胞亚群的CD1d表达没有明显差异(图2K)。因此，激活的T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞参与了代谢紊乱的调节。

图2 小鼠脂肪和脾脏T-bet⁺ B细胞阳性率和表面表型与体重增加相关

辅图2 T-bet^-和T-bet⁺ B细胞的比较，与图1相关

辅图3 诱导的肥胖不影响脾脏中一般B细胞亚群的阳性率，与图2相关

3.肥胖时iNKT细胞促进T-bet⁺ CD11c⁺B细胞的增加

       之前的结果表明在肥胖小鼠和肥胖人群脂肪组织中，T-bet⁺ B细胞表面的CD1d含量低于T-bet^- B细胞。接下来研究人员利用t分布随机邻域嵌入(tSNE)算法(小编注：tSNE是一种非线性降维算法，适用于高维数据降维到 2维或者3维，进行可视化)对流式细胞术数据进行分析，探究CD1d受限的iNKT细胞是否影响HFD喂养小鼠中T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞的累积。使用来自NCD小鼠或HFD小鼠的WT和iNKT细胞缺失Cd1d1^-/-的脾细胞，并用B细胞、T细胞、iNKT细胞以及T-bet和CD11c对脾细胞进行了标记。tSNE算法识别了一个独特的CD19⁺ B220⁺ B细胞亚群(图3A，“B细胞集群2”;辅图4)，它与CD19⁺ B220⁺ B细胞的主要集群分离 (图3A，“B细胞集群1”)。B细胞簇2比B细胞簇1表达更多的T-bet和CD11c蛋白(图3A)。值得注意的是，之前在HFD小鼠观察到比NCD小鼠脂肪组织中T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞比例增加的现象在HFD喂养的Cd1d1^-/-小鼠中并没有出现(图3B)。此外，与 HFD饲喂的WT小鼠相比，HFD饲喂的Cd1d1^-/- 小鼠脾T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞比例减少(图3C)。因此，即使脂肪iNKT细胞的数量随着肥胖的增加而减少，它们的存在依然是肥胖过程中T-bet⁺ B细胞增加所必须的。由于iNKT具有促炎和抗炎的双重性质，研究人员分析了HFD饲喂的WT小鼠附睾脂肪组织中iNKT的性质。结果发现肥胖的脂肪组织中iNKT偏向于产生INF-γ的促炎NK1.1+ iNKT亚群，而不是产生IL-10的NK1.1- iNKT亚群。

       文献报道，T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞通过在疾病进展或感染期间产生IgG2c在病毒感染和自身免疫性疾病中发挥作用。因此，研究人员测定了NCD或HFD喂养的WT小鼠和iNKT细胞缺陷Cd1d1^-/-小鼠的血清Ig效价。结果显示，HFD喂养的野生小鼠IgG2c和IgM浓度高于NCD喂养的野生小鼠，而IgG1没有差异(图3D-3F)。但与NCD喂养的野生小鼠相比，HFD喂养的Cd1d1^-/-小鼠的IgG2c或IgM未检测到增加(图3D-3F)。合并WT和Cd1d1^-/-样本分析，脾脏T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞比例与血清IgM和IgG2c浓度之间存在显著相关性(图3D-3F)。以上研究结果表明，肥胖过程中T-bet⁺ CD11c⁺B细胞增加以及IgG2c和IgM的产生是由能够产生IFNγ的促炎iNKT细胞亚群诱导的。

图3 在饮食诱导的肥胖中T-bet+ CD11c+ B细胞的扩增依赖于iNKT细胞

辅图4 对NCD或HFD喂养的WT和Cd1d1-/-小鼠进行无监督tSNE分析，与图3相关

4.先天性信号驱动T-bet⁺ CD11c⁺B细胞增加并且是iNKT细胞依赖的

       以上的研究结果表明T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞的增加是iNKT细胞依赖的，接下来研究人员探究了其他方法诱导T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞增加是否也需要iNKT细胞存在。已有文献报道体外刺激通过TLR7可显著上调B细胞中T-bet含量。为了评估TLR7激活对体内B细胞的影响，研究人员在第0天和第2天对小鼠腹腔注射50μg TLR7激动剂R848，并在第4天取小鼠脾脏进行检测。结果显示，与未注射R848的小鼠相比，注射R848的小鼠的B细胞体积变大，T-bet、CD69和CD86蛋白水平上调，而CD21、CD23和CD1d蛋白水平下调(图4A)。为了证实TLR7驱使T-bet⁺ B细胞增加的特异性能力，研究人员继续向小鼠注射R848。与对照小鼠相比，注射R848的小鼠体内仅表达CD11c或同时表达T-bet和CD11c以及CD138⁺浆母细胞的B细胞比例显著增加(图4B-4G)。随着T-bet⁺CD11c⁺ B细胞数量的增加，过渡性2型(T2)和过渡性T2-边缘区前体(T2- MZP) B细胞(小编注：从骨髓迁移至血液和脾脏的B细胞被称为过渡1（T1）B细胞。进入脾脏后，T1 B细胞可逐渐发育成熟并成为过渡2（T2）B细胞。在脾脏中，T2 B细胞将转变为滤泡性（FO）B细胞、边缘区（MZ）B细胞或B1细胞)数量显著减少，提示T-bet⁺CD11c⁺ B细胞群可能是由T2或T2-MZP细胞转变而来的。而在R848处理和未处理的小鼠中，过渡型1 (T1)B细胞、边缘区B细胞(MZB)、滤泡B细胞(FOB)、生发中心B细胞(GCB)或CD21-CD23-B细胞的比例没有差异(图4H)。以上这些结果表明，TLR7参与驱动可能来源于脾脏前体细胞亚群的T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞的增加。

       接下来，研究人员探索了TLR7驱动表达T- bet B细胞增加是否需要iNKT细胞的存在。流式结果表明，注射R848的WT小鼠中T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞比例显著增加，而注射R848的iNKT细胞缺失的Cd1d1^-/-小鼠T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞出现了上升趋势，但不具有统计学意义(图4I)。有文献报道，T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞增加部分依赖于IFNγ，而TLR7能够诱导iNKT细胞产生IFNγ，所以研究人员接下来探究了iNKT细胞是否为IFNγ的潜在来源。研究人员检测了IFNγ报告基因小鼠中eYFP⁺的表达，发现与未注射R848的IFNγ报告基因小鼠相比，注射R848的IFNγ报告基因小鼠中表达IFNγ的iNKT细胞显著增加，而常规T细胞中则显示IFNγ没有增加(图4J)。因此，iNKT细胞通过表达IFNγ支持TLR7驱动T-bet⁺ CD11c⁺B细胞的增加。 

       由于iNKT细胞的糖脂激活会诱导IFNγ的产生，研究人员接下来探究了直接激活iNKT细胞是否可以促进T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞的增加。为此，研究人员向WT和iNKT细胞缺陷的Ja18^-/-小鼠腹腔注射0.5 mg iNKT细胞特异性配体α -半乳糖神经酰胺(α-GalCer)，并在4天后检测脾脏T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞是否增加。结果显示，注射α-GalCer的WT小鼠与未注射对照组相比，T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞显著积累。然而，这一现象在iNKT细胞缺乏的Ja18^-/-小鼠中则未观察到(图4K)。这一结果表明，糖脂可以激活iNKT细胞特异性分泌IFNγ，支持T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞的增加（小编注：α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)是一种人工糖脂，它是从海绵Agelas Mauritianus中提取的鞘脂开发而来的。α- GalCer可以与iNKT细胞表面存在的iTCR结合，导致iNKT细胞活化，会引起高水平的细胞因子产生。所以α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)算是一种糖脂激活信号）。

图4 先天性信号诱导的T-bet+ CD11c+ B细胞扩增依赖于iNKT细胞

5.T-bet⁺ B细胞分泌CXCL10，加重肥胖过程中的代谢紊乱

       先前研究数据表明，与滤泡B细胞相比，表达T- bet的CD11b⁺ B细胞中Cxcl10 mRNA表达增加，并在滤泡B细胞中发现IFNγ能够诱导Cxcl10的转录。为了检测表达T- bet的B细胞是否也能够分泌CXCL10蛋白，研究人员在体外用2.5μg/mL的 R848刺激分离的B细胞2天。结果显示，体外使用R848刺激培养的B细胞与体内R848刺激后的B细胞具有相似的表型: 与未使用R848刺激培养的B细胞相比，细胞体积变大，T-bet、CD69和CD86蛋白表达增加，CD21和CD1d蛋白表达降低(图5A)。另外，与未刺激相比，体外R848刺激可促进B细胞CXCL10分泌增加(图5B)。接下来研究人员给WT小鼠注射了R848，并检测血清中CXCL10的浓度，来探索R848是否也可以在体内引起CXCL10的产生。与体外实验结果一致，注射了R848的小鼠血清中CXCL10含量显著高于未注射R848的小鼠(图5C)。以上结果说明，不管是在体内还是在体外，R848的刺激都会促进CXCL10的分泌。 

       已有报道称CXCL10和其他B细胞因子（如IL-1β、IFN-γ、TNF-α）会加重T2D和代谢性疾病，因此研究人员进一步评估活化的T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞是否在肥胖期间的代谢性疾病发展中发挥作用。先前的研究表明同时刺激TLR7、BCR和IFNγ受体是上调B细胞T-bet蛋白水平的有效途径。因此，研究人员给表达NP特异性BCR的B1-8^hi转基因小鼠注射了可以与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)结合的NP，并在第3天用R848增强效果(辅图5A)。结果显示，与对照小鼠相比，实验组小鼠在第4天脾脏中产生了明显的T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞的积累(辅图5B)。分离T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞并向受体小鼠进行移植，移植后小鼠继续按照先前的饮食进食4天，然后评估葡萄糖耐量(辅图5C和5D)。结果发现，接受NP-KLH/R848诱导的T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞移植的NCD喂养的瘦小鼠与接受普通B细胞移植或未进行B细胞移植的小鼠相比，葡萄糖耐量没有显著差异(图5D和辅图5C)。然而与未接受B细胞移植的HFD饮食小鼠相比，接受T-bet⁺ CD11c⁺B细胞移植的HFD喂养的肥胖小鼠的葡萄糖耐量受损更为显著(图5E和辅图5D)。有趣的是，接受正常饲喂小鼠B细胞移植的HFD小鼠，出现了与接受R848诱导的T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞移植的HFD小鼠相似的葡萄糖耐量受损加重现象（小编注：移植之后还继续进行了4周的HFD喂养，这时WAT中B细胞总量增多，HFD饮食诱导iNKT促炎方向亚群增多，激活了移植进来的B细胞，使得WAT中T-bet⁺ B细胞数量增多，进而导致代谢变坏）。这表明移植来自正常小鼠的B细胞可能会激活现有的低水平的T-bet⁺ B细胞，即使没有R848诱导，也足以加剧葡萄糖耐量受损 (辅图5D)。综上，T-bet⁺ CD11c⁺B细胞的积累会在肥胖过程中加重葡萄糖耐量受损。

图5 表达T- bet的B细胞分泌CXCL10并导致肥胖的代谢紊乱

辅图5 B细胞转移到NCD喂养或HFD喂养的小鼠；T bet⁺ B细胞缺陷小鼠的特性。与图5和图6相关

6.B细胞中Tbx21的敲除限制了CXCL10的表达和肥胖过程中的代谢紊乱

       接下来，为了直接研究表达T-bet的B细胞在肥胖中的代谢紊乱发生发展过程中的作用，研究人员通过将Tbx21^flox/flox小鼠与在Cd19启动子控制下表达Cre重组酶的小鼠杂交，特异性地敲除B细胞中由Tbx21编码的T-bet。为了证实这些小鼠的B细胞特异性缺乏T-bet表达，研究人员从T-bet缺陷的KO小鼠(Tbx21^flox/flox Cd19^Cre/Cre)、HET小鼠(Tbx21^flox/flox Cd19^Cre/+)（小编注：CD19双cre不会有任何可见的明显表型，但会使该小鼠缺乏B细胞B-1亚型，表现为血清IgM减少，对T细胞依赖抗原反应能力严重受损，无法形成供B细胞增殖与生长的脾脏生发中心。故而实际应用中还是以杂合cre为主。本文后续也使用了杂合cre小鼠。但是这里作者的定义是HET）或WT小鼠(Tbx21^wt/wt Cd19^Cre/+)中收集脾细胞，结果证实的KO和HET小鼠的B细胞内不表达T-bet蛋白，但T细胞仍然表达(辅图5G)。接下来研究人员检测了从KO小鼠 (Tbx21^flox/flox Cd19^Cre/Cre)、HET小鼠(Tbx21^flox/flox Cd19^Cre/+)或WT小鼠 (Tbx21^wt/wt Cd19^Cre/+)的尾部组织、脾脏B细胞或非B细胞中分离的DNA 中获得的Tbx21基因的DNA序列，进一步证实了KO和HET小鼠B细胞亚群特异性T-bet的缺失(辅图5H)。此外，研究人员还检测了脾B细胞激活后T-bet的表达。结果显示，与未注射R848小鼠相比，注射R848的WT鼠的B细胞T-bet蛋白水平上调(辅图5I)，这与先前实验结果类似(图4A)。相反，R848刺激并没有诱导来自HET小鼠B细胞的T-bet表达(辅图5E)。因此，HET小鼠在B细胞中特异性不表达T-bet，而WT小鼠正常表达T-bet。 

       在体外通过刺激TLR7激活B细胞，可以诱导T-bet表达和CXCL10的分泌。因此，研究人员测定了CXCL10在缺乏T-bet的B细胞中的表达。结果发现，瘦小鼠T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞中CXCL10蛋白的表达水平明显高于自身的常规B细胞(图6A)。由于大多数小鼠CD11c⁺ B细胞表达T-bet(图2E)，因此研究人员用CD11c的表达水平作为T-bet表达水平的替代参数，来评估靶向缺失T-bet后CXCL10在该B细胞亚群中的表达。结果显示，与NCD饲喂的WT小鼠相比，HFD喂养的WT小鼠脾脏中CXCL10⁺ CD11c⁺ B细胞的比例显著增加(图6B)。重要的是，与NCD饲喂的HET小鼠相比，HFD喂养的HET小鼠脾脏CXCL10⁺ CD11c⁺ B细胞完全不积累(图6B)。因此，CXCL10在缺乏T-bet的B细胞中的表达水平较低，而HFD饮食相比于NCD饮食更有利于CXCL10的表达。 

       最后，研究人员评估了T-bet B细胞缺陷是否影响代谢性疾病的临床症状。结果显示，与HFD喂养的WT小鼠相比，HFD喂养的HET小鼠的葡萄糖耐量显著提高(图6C)。值得注意的是， T-bet⁺ B细胞缺乏甚至会适度改善瘦小鼠的葡萄糖耐量(图6D)。 

       本研究的数据全部来自女性患者和以雌性为主的小鼠。肥胖期间雌性小鼠脾脏中T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞的积累比雄性小鼠更为明显。相应地，B细胞中Tbx21被特异敲除的小鼠只在雌性中检测到葡萄糖耐量的改善(图5)。相比之下，肥胖过程中雄性小鼠脾脏T-bet⁺ CD11c⁺ B细胞比例增加幅度较小，而且B细胞中Tbx21被特异敲除的雄性小鼠没有显示出葡萄糖耐量的提高(辅图5K)。

       为了了解T-bet⁺ B细胞加剧代谢性疾病的机制，研究人员进一步探究了HET小鼠的免疫代谢情况。首先，科研人员发现HFD喂养的HET小鼠的体重增加少于WT小鼠(图6E)，在总体重和内脏脂肪表现均明显(图6F)。但是这些小鼠之间的体重差异并不是T-bet⁺ B细胞缺陷小鼠脂质储存减少的结果。相反，研究人员发现T-bet⁺ B细胞缺陷小鼠的肝脏和脂肪组织中脂质储存都有适度增加。油红O染色结果表明，无论NCD还是HFD饲喂，与WT小鼠相比，HET小鼠的脂质染色增加(辅图6A和6B)。同样地，与WT小鼠相比，HFD喂养的HET小鼠脂肪细胞直径也有一定程度的增加(辅图6C和6D)。为了探究来源于T-bet⁺ B细胞的CXCL10在体重或脂质储存差异中的作用，研究人员构建了CXCL10缺陷的T-bet⁺ B细胞混合BM嵌合体小鼠并进行8周的HFD喂养。发现两组小鼠对糖耐量无差异(辅图7C)。相反，T-bet⁺ B细胞中缺乏CXCL10的小鼠在最初几周HFD喂养过程中食物摄入量较低，并且在测试过程中体重增加较少(辅图7C-7E)，这表明T-bet⁺ B细胞分泌CXCL10刺激了肥胖期间的早期体重增加，而不是后期的炎症变化。 

       在肥胖期间T-bet⁺ B细胞会刺激脂肪组织淋巴细胞数量的改变。流式实验结果证实，HFD喂养的WT小鼠中脂肪组织中CD45⁺淋巴细胞比例增加，但在缺乏T-bet⁺ B细胞的小鼠中未见增加趋势(图6G)。与此一致的是，HFD喂养的WT小鼠脂肪组织巨噬细胞增加，但HET小鼠中没有增加(图6H)。此外，在HFD喂养的WT小鼠中，超过50%的脂肪组织巨噬细胞是M1型炎症巨噬细胞，HET小鼠情况与WT小鼠相似，这表明尽管HET小鼠巨噬细胞比例低于WT小鼠，但进入脂肪的巨噬细胞仍然使小鼠出现了预期的炎症表型（小编注：高脂条件下，敲除t-bet后小鼠体重减轻，糖耐量改善，炎症减轻）(图6I)。

       ELISA结果显示，NCD和HFD饮食的WT小鼠和HET小鼠IgM和IgG水平均无显著差异(图7A和7B)。因为T-bet⁺ B细胞通常在小鼠体内产生IgG2c，因此正如预期，与野生型小鼠相比，NCD和HFD饮食条的T-bet⁺ B细胞缺乏小鼠血清中总IgG1水平无显著差别，但IgG2c水平显著降低(图7C和7D)。此前已经有证据表明T-bet⁺ B细胞分泌的IgG2c在疾病进展期间具有致病性，因此研究人员接进一步探究了T-bet⁺ B细胞来源的IgG2c对代谢性疾病的潜在作用。研究人员将肥胖的WT小鼠的血清转移到HET小鼠体内，结果发现HET小鼠的葡萄糖耐量受损，基础葡萄糖水平也有所升高(图7E和7F)。HFD血清的影响可能归因于IgG，因为从HFD喂养的WT小鼠血清中分离的IgG 明显损害了HET小鼠的葡萄糖耐量(图7E和7F)。与野生型小鼠相比，HET小鼠附睾脂肪组织巨噬细胞数量减少，但其F4/80⁺ CD11b⁺ 巨噬细胞的比例可以通过移植HFD喂养小鼠血清IgG的得到恢复(图7H)。综上所述，T-bet⁺ B细胞产生IgG2c，这在一定程度上通过招募脂肪组织巨噬细胞加剧肥胖期间的代谢紊乱。以上这些数据共同研究了B细胞一个关键亚群在肥胖中的病理作用，并为未来旨在逆转肥胖和T2D代谢紊乱发展的免疫疗法确定了一个新的靶点。

图6 敲除B细胞中的Tbx21可改善代谢症状，限制脂肪体重增加，并减少肥胖期间脂肪组织中的炎症巨噬细胞浸润

图7 小鼠缺乏T-bet⁺ B细胞导致血清中IgG2c降低和葡萄糖耐量改善，但移植HFD喂养小鼠的血清或从中纯化的IgG可恢复代谢性疾病并增加脂肪组织中巨噬细胞

辅图6 与正常对照组小鼠相比，缺乏T bet⁺ B细胞的小鼠在HFD喂养时保留了肝脂水平更高，脂肪细胞直径增加，与图6相关

辅图7 混合BM嵌合体限制了T bet⁺ B细胞CXCL10缺陷，并揭示了CXCL10在HFD喂养小鼠早期体重增加中的作用

总结

肥胖伴随着脂肪组织炎症、糖耐量受损和脂肪淋巴细胞数量的改变。在本研究中，研究人员发现脂肪组织中T-bet⁺ B细胞的积累依赖于iNKT细胞，并与肥胖期间的体重增加相关。移植T-bet⁺B细胞可加重肥胖的代谢紊乱，而特异性敲除B细胞中的Tbx21（编码 T-bet）可降低血清IgG2c水平，减少炎症因子和脂肪组织中的炎症巨噬细胞，改善代谢症状。此外，移植来源于HFD小鼠的血清或纯化的IgG使得T-bet⁺ B细胞缺陷小鼠改善的代谢紊乱重新加重，证实了T-bet⁺ B细胞来源的IgG是肥胖期间炎症的关键媒介。总之，这些发现揭示了T-bet⁺ B细胞的重要病理作用，为未来肥胖、2型糖尿病和其他炎症疾病的免疫治疗提供了关键信息。