导 读

      研发精准高效的线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）基因编辑方法，一直是相关领域关注的热点和难题，对治疗线粒体疾病具有重要的意义。随着基因编辑技术的发展，目前已经可以通过向线粒体靶向转导DNA酶（如TALEN、ZFN等）或单碱基编辑器，实现部分mtDNA分子的编辑。但是，近年来广泛用于核基因编辑的CRISPR/Cas9体系是否可以编辑mtDNA，一直备受争议。近期，中国科学院昆明动物研究所姚永刚团队，通过建立线粒体靶向的CRISPR/Cas9体系，对细胞内的mtDNA分子进行编辑，并通过三代测序技术直接验证到成功编辑后的mtDNA分子，这为CRISPR/Cas9体系可以编辑mtDNA提供了最直接的实验证据。

图1 靶向线粒体的CRISPR/Cas9体系可成功编辑细胞内线粒体的mtDNA分子

  线粒体是细胞的能量代谢枢纽和信号转导交汇站，其功能异常往往会影响高耗能的组织器官（如神经和肌肉组织），也与其他细胞功能如抗病毒效应等密切相关。线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）是线粒体中独立于核基因组的一套遗传物质。每个细胞根据自身功能的不同，可含有成百上万个mtDNA分子，其中部分mtDNA突变，构成了细胞内mtDNA分子的异质性。mtDNA突变被发现与多种疾病相关（包括神经退行性疾病、耳聋、肌肉萎缩等），目前这类疾病尚无有效的治疗方法。

  随着基因编辑技术的发展，通过CRISPR/Cas9、单碱基编辑等技术，可实现核基因的高效编辑。但线粒体基因的高效编辑存在诸多难题，主要原因有以下方面：首先，线粒体是细胞中具有双层膜结构包被的细胞器。mtDNA位于线粒体内部，受到线粒体双层膜的保护，外源的基因编辑工具很难高效进入线粒体内部。其次，mtDNA不同于核基因组DNA，缺乏高效的DNA损伤修复机制，一旦受到双链断裂损伤，就会被降解。最后，根据细胞类型与功能的不同，每个细胞中mtDNA的拷贝数从几百到几万个不等，要同时实现对细胞中大多数mtDNA分子进行精准高效的编辑，是一个非常有挑战的难题。

  幸运的是，多个研究团队研发了线粒体靶向定位的DNA酶（如TALEN、ZFN等），可以改变胞内mtDNA突变异质性的比例。近期研发的mtDNA单碱基编辑体系，也在细胞层次，以及动物和植物体内实现了mtDNA突变的单碱基编辑。由于单碱基编辑体系会改变同一编辑窗口中的其他碱基，导致编辑的精准性不足；同时，现有的mtDNA编辑技术，仅局限于修饰一定类型的基因突变，针对颠换、插入和缺失等类型的mtDNA基因变异，目前尚无解决方案。这些问题，限制了相关基因编辑技术在线粒体疾病动物模型建模和基因治疗等方面的应用。CRISPR/Cas9技术有望克服这些局限性。线粒体靶向的CRISPR/Cas9体系在近期研究中被报道可实现mtDNA的编辑，但这些研究都是基于基因扩增（PCR）的方式，来间接验证mtDNA分子是否被编辑。这一方法不能排除鉴定得到的被编辑的mtDNA分子来源于假阳性扩增的可能性，这也是为何关于CRISPR/Cas9技术能否编辑mtDNA，仍然备受争议的根本原因。

  来自姚永刚团队的毕蕊博士等人，通过在Cas9蛋白上游融合线粒体引导肽，下游配置线粒体基因的3'-端非编码（3'-UTR）序列，优化建立了靶向线粒体的CRISPR/Cas9体系mito-Cas9。该体系转染细胞后，可以实现Cas9蛋白和相应的引导RNA（sgRNA）靶向线粒体的转运（图2）。