从基因克隆到蛋白表达

第一步：进行基因扩增

1、已知基因序列、名称或功能：通过文献中提供的序列号在NCBI网上搜索；或已知基因功能或名称，通过在NCBI中搜索菌种名称、基因名称或基因功能，设计引物进行克隆。

2、已知部分基因的克隆：gemonic walking、RACE

第二步：基因序列分析：

1、了解Domain的构成情况:

SMART: http://smart.embl.de/; SWISS: http://smart.embl.de/

2、分析基因的酶切位点（可参考的软件DNAMAN），设计引物；

3、分析下一步所要用载体的酶切位点：pET载体

4、是否含有稀有密码子。工具：Rare Codon Caltor（补充：GCUA）

5、是否有二硫键。工具：PredictProtein

6、是否含有信号肽。工具：SignalP, PsortII，http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

有信号肽一定要去除信号肽，大肠杆菌表达系统没有信号肽切除系统，但是活性蛋白是不包含信号肽的，所以，在一开始重组的时候就应该把信号肽切掉。

7、磷酸化和糖基化位点。工具：Netphos, YinOYang , NetNGlyc, NetOGlyc

第三步：重组表达载体的构建：

❶目的基因PCR的引物加上酶切位点（注意，此酶切位点一定是pET28多克隆位点上的位点，且目的基因的ORF没有的序列），进行PCR扩增。

❷扩增的阳性片段连接pMD19-T载体，在Amp/IPTG/X-gal平板上进行阳性克隆的筛选（蓝白斑筛选，白色的菌落为插入目的基因的阳性克隆），将阳性克隆并采用M13F或M13R进行测序。

第四步：蛋白表达与纯化

构建载体在不同的菌株中表达，同时尝试不同的诱导条件，包括：诱导时OD值、诱导温度、IPTG浓度、诱导时间。SDS－PAGE电泳及Western－Blot分析表达结果。同时进行细菌生长曲线作图，观察目的蛋白对宿主菌是否有毒害作用。

【参考书目】：

pET System Manual

The_QIAexpressionist