赤拟谷盗：精心设计遗传工具包和随机大规模 RNAi 筛选以研究昆虫生物学和进化

赤拟谷盗（Tribolium castaneum ）是重要昆虫模型系统。在研究基因功能方面，仅次于黑腹果蝇D. melanogaster。赤拟谷盗中的 RNAi 反应异常强烈且具有系统性，它似乎可以针对所有细胞类型和过程。作为一种独特的新兴模式生物，赤拟谷盗提供了短时间、低成本大规模 RNAi 筛选的机会，该筛选基于针对所有基因，只需将dsRNA其注入体腔。赤拟谷盗于饲养，相对较短的世代时间满足了完善的转基因和基因组编辑方法。因此，许多转基因工具，如UAS/Gal4、Cre/Lox、成像线和增强子陷阱线已经可用。赤拟谷盗几十年来一直是一个遗传实验系统，现在已成为分子和反向遗传学以及体内成像的主力。与黑腹果蝇相比，这种甲虫的发育和一般生物学的许多方面都更具昆虫特征. 因此，通常利用在果蝇中已被充分研究的基因作为直系同源物，在甲虫发育过程中进行宏观进化比较，例如轴形成、身体分割和附肢、头部和大脑发育。转基因方法为体内成像开辟了新途径。此外，这种新兴的模型系统是研究未在飞行中代表或难以在那里研究的过程的首选，例如胚胎外组织、隐肾器官、臭腺功能或基于 dsRNA 的杀虫剂。

作为一种典型的全代谢昆虫，赤拟谷盗存在几个幼虫阶段（通常是 7 个，但饥饿时为 5 或 6 个，以及根据一些流传的说法高达 11 龄）然后变态（图 1）。其胚胎发育舒适区介于 22 至 32 °C 之间，25 °C 持续 7 天，32 °C 持续 3 天 。同样，从卵到成虫的发育随着温度从 22.5°C 的 74 天加速到 32°C 的约 23 天，这对于大规模基因实验来说足够短了。

作为贮藏产品的主要害虫，赤拟谷盗长期以来一直被用于研究害虫管理和杀虫剂抗性。虽然早期的研究集中在杀虫剂抗性的机制和传播上，但最近人们对使用赤拟谷盗作为模型系统在甲虫和其他昆虫中测试基于 dsRNA 的杀虫剂产生了兴趣。在 RNAi 介导的害虫防治中，靶向害虫物种必需基因的 dsRNA 被喷洒到植物上，或由转基因作物产生。以作物为食后，dsRNA 会在害虫中诱导 RNAi，导致其死亡。迄今为止，赤拟谷盗已作为筛选工具来鉴定最有效的靶基因。将来，它可能对优化目标序列和研究 RNAi 动力学有用。由于在甲虫和其他害虫物种中系统性诱导 RNAi 的能力差异很大，因此 dsRNA 吸收和传播的机制也成为焦点，这可以在赤拟谷盗进行深入研究。

RW Beeman 在赤拟谷盗中发现了自私 DNA 的一个最有趣的例子，它导致了遗传杂交中的偏斜分离比率，命名为 MEDEA（母体效应显性胚胎逮捕）。这种元素可以通过垂直传播在甲虫种群中传播，杀死所有没有继承 MEDEA 元素的后代。支撑 MEDEA 的原理由母体表达的毒素和合子表达的解毒剂组成，这些结构应该类似地在自然种群中传播，并可用于特定物种抑制害虫和媒介物种 。

主力技术：稳健和系统性的 RNA 干扰

通过 RNAi 进行基因敲除是一种在赤拟谷盗中异常稳健和高效的技术。表型的外显率通常接近 100%（即所有注射过的动物及其所有后代通常都表现出一种表型），并且在大多数情况下观察到与基因突变的 Null 表型相当的表型强度，例如对于 Hox 基因Tc-性梳减少，图案基因Tc-Krüppel和Tc-knirps 和Tc-Distal-less ，以及眼睛颜色酶Tc-vermillion。迄今为止测试的所有组织和过程都适用于 RNAi，包括生理过程，如角质层 和色素形成 、免疫和神经内分泌处理。已经研究了胚胎和胚胎后模式的表皮 、胚胎外组织、大脑和肌肉形成。

重要的是，RNAi 效应是环境的，即细胞外 dsRNA 被细胞吸收并引发沉默。因此，在注射到体腔后，dsRNA 通过血淋巴分布，似乎被整个生物体中的所有细胞吸收。当从普遍存在的启动子表达的 EGFP 在所有组织中被沉默时，这一点得到了令人信服的证明。我们不知道还有不适合 RNAi 的组织或阶段。因此，注射到任何生命阶段的体腔都会导致大多数（如果不是所有）细胞的基因敲除。胚胎可以在后期注射，早期基因功能不受影响，注射到 L5 或 L6 幼虫中通常用于获得影响变态的表型（图 2）。

图 2. 角质层表型和原位染色

RNAi 效应甚至会从母亲传递给后代，因此注射到雌性蛹或成虫中也会导致后代被击倒 。沉默的强度可以通过滴定注射 dsRNA 的浓度来调整，也可以通过在注射母体后的不同时间点收集胚胎来调整。dsRNAs 也被培养中的细胞吸收。dsRNA 摄取的分子基础在赤拟谷盗中仍然是个谜，它似乎涉及网格蛋白依赖性内吞作用。口服 dsRNA 的试验在不同的实验室中取得了不同的成功。RNAi 沉默是否可以从一个细胞传播到另一个细胞（即全身性 RNAi 严格意义上的）仍有待测试。总之，几乎每个组织中的每个基因都可以在将 dsRNA 注射到栗树的任何阶段后被强烈沉默。

成本和时间有效的 RNAi 筛选，用于基因功能的无偏检测

赤拟谷盗的一个突出优势是易于进行大型或中型 RNAi 筛选。作为iBeetle筛选的一部分，生成了全基因组模板集合，基于这些模板可以对 dsRNA 进行商业订购，从而无需克隆。该资源与显微注射的简便性（学生在一天内学习该过程）一起，使中型或大型 RNAi 筛选能够搜索新的基因功能或测试来自组学分析的基因列表。根据我们的经验，通量的上限是每个筛选器每周大约 100 个基因（包括注射、处理和筛选一个简单的表型，如致死率）。这是一个特别复杂的筛选系统，因为许多不同类型的表型被并行评分，导致每个筛选器每周 21 个基因的吞吐量相对较低。根据这些经验，测试所有转录因子（大约 800 个基因）将需要 8 到 13 周，具体取决于读数的复杂性。因此，赤拟谷盗是一个极好的系统，用于快速测试许多基因的功能，例如基于组学候选基因列表。

精心设计和扩展的转基因工具包

赤拟谷盗是第一个成功应用基于人工 Pax 响应增强剂的 3xP3 眼标记物的物种；3xP3 已成为许多昆虫中转基因构建体的标准元素。除了piggyBac转座子，其他转座因子系统，如Minos 或玉米Ac/Ds（Distler 和 Klingler 未发表）也可用作转基因载体。转基因如在黑腹果蝇中进行，通过将含有转座子序列的质粒注射到早期胚盘阶段，该质粒与作为转座酶来源的辅助质粒或 mRNA 混合。转基因的效率与在黑腹果蝇中使用 P 元素的效率相似，并且插入的基因组分布非常随机。已经建立了热休克和 UAS/Gal4 介导的基因错误表达，已经测试了几种增强子的活性建立了专用的体内成像线。值得注意的是，从黑腹果蝇中提取的增强子和核心启动子在T. castaneum，因此建议使用内源性元素。已被证明在增强子捕获和遗传构建中有效的核心启动子包括Tc-hsp68和超级核心启动子 1 ( SCP1 )——后者在黑腹果蝇和赤拟谷盗中均具有活性。Cre-Lox 介导的重组正在有效地发挥作用 为脑弓等翻转技术开辟了道路。

驱动特定模式的增强子的识别和表征是许多应用中的限制步骤。几种预期会驱动普遍表达的增强剂，例如Tc-α-微管蛋白、Tc-EF1-α和Tc-多聚泛素似乎并非在所有阶段的所有细胞中都具有活性，并且经常表现出斑片状或镶嵌状表达（Averof 和 Bucher ，未发表）。许多通过将推定的发育增强子放在报告基因前面来测试它们的努力都失败了。通过考虑染色质可及性和使用额外的生物信息学预测，可以提高识别活性增强子的可能性。顺式普遍表达基因的调节元件通常位于转录起始位点上游的几千个碱基内。