韧皮部（phloem）是维管植物进行营养和信号分子运输的重要组织。在拟南芥根尖初生生长中，两个韧皮部区域对称分布于维管束中，由一排木质部（xylem）细胞及其两侧的形成层前体细胞（procambium）间隔开。韧皮部由初生韧皮部筛管（protophloem sieve element，PSE）和次生韧皮部筛管（metaphloem sieve element，MSE），以及其紧临的两个伴胞细胞（companion cell，CC）组成（图1）。近年来，许多参与调控韧皮部发生的基因被陆续发现，其参与的分子调控机制正在逐步地被揭示，但是韧皮部细胞分裂和特化过程中具体如何按既定发育路线形成有序的空间排布（细胞图式发育，cell developmental patterning）的机制还不清楚。

图1 拟南芥根尖初生生长维管束横切示意图。

在细胞分裂和特化的过程中，决定细胞特定性质的信号网络通常由少数转录因子所主导。为了全面理解植物根尖维管束韧皮部发育的机理，研究人员早在10年前整合了多种已发表的转录组数据，从中挑选近30个韧皮部富集的转录因子（phloem-enriched transcription factor）。通过构建诱导型基因超表达载体并转化到PSE和CC荧光蛋白GFP表达报告植株，检测这些基因超表达后是否引起报告基因表达异常和根生长异常，以确定该候选基因是否参与调控韧皮部发育。通过这一策略，筛选到了一类DOF转录因子（phloem-Dof），其超表达能够引起SUC2异位表达和根的异常生长。

进一步研究发现，phloem-Dof超表达不仅能够促进细胞的增殖，而且能特异地诱导其他类型细胞完成韧皮部筛管和伴胞细胞完整的发育过程。相对应的，敲除这些phloem-Dof基因能够引起韧皮部缺失（图2A）。通过短时间（16小时）诱导基因超表达后的转录组分析证实，phloem-Dof能够上调一系列韧皮部正调控因子（包括SMXLs，APL，CVP2和OPS等）和cell cycle相关基因（包括CYCA2，CYCD3，CYCD4和CYCD6等）。由于多数phloem-Dof在整个韧皮部发育过程表达，因此，综上结果明确了phloem-Dof是主导整个韧皮部发育的关键调控因子。

图2 （A）野生型Col、dof六重突变体、cle25/26/45三重突变体、以及CLE25外源小肽处理后根尖分化区维管束横切；（B）DOF2.2超表达后诱导韧皮部特异表达的CLE25异位表达；（C）CLE25抑制DOF5.3蛋白表达，但其转录水平不受影响。

细胞发育图式的建立往往通过各种正向和负向的信号网络调控完成。通过转录组分析，研究人员发现phloem-Dof也能够特异结合韧皮部的负调控因子CLE25/26基因的启动子和内含子等区域并诱导其表达（图2B）。虽然已有研究报道，CLE25、CLE26、CLE45能够抑制韧皮部的发育（Ren et al. 2019，JIPB；Anne et al. 2018，Development；Depuydt et al. 2013，PNAS），但是由于未能发现其突变体明显的韧皮部缺陷表型，其内在的生物学功能至今尚未明确。鉴于CLE是分泌型小肽，研究人员推测CLE25、CLE26、CLE45功能冗余，且通过胞间侧向抑制调控韧皮部发育。为了证实这一假设，研究人员构建了cle25/26/45三重突变体，通过详细追溯和比较野生型与突变体韧皮部前体细胞系的发育轨迹，发现野生型初生韧皮部和原形成层细胞都来源于筛管和伴胞的前体细胞，原形成层细胞作为子细胞直至次生生长并未进行分裂；相比较，突变体韧皮部前体细胞虽然与野生型分裂模式相同，但是原形成层细胞也能分化为筛管和伴胞细胞（图2A）。

研究人员进而又筛选到受体类激酶BAMs和CIKs可能为CLE25/26/45的受体系统，并且通过ITC实验证明BAM1、3直接与CLE25/26/45互作，小肽和受体互作的亲和力也解释了为何bam3单突就对CLE45（活性最弱）不敏感。同时发现bam1/2/3三突和cik2/3双突（CIKs已被证实其为BAMs共受体，Hu et al. 2021，New Phytol）表现出cle25/26/45三突表型。进一步的遗传分析（构建cle cik五突以及dof cik八突）更加证实了Dof-CLE-BAM/CIK为同一信号通路。上述结果表明phloem-Dof直接靶向调控CLE小肽，使其分泌到胞外由BAM/CIK受体系统接收从而侧向抑制周边原形成层细胞分化为筛管和伴胞细胞。

接下来两个重要问题需要回答：（1）CLE激活的BAM-CIK受体复合体是如何抑制周边细胞的韧皮部形成的呢？研究人员发现CLE25通过转录后调节使phloem-Dof蛋白质的量减少，这种DOF-CLE的负反馈调节阻碍了韧皮部的形成（图2C）。（2）原本应该分化为韧皮部的细胞为何没有受到CLE信号的抑制？研究人员进一步发现多种phloem-Dof通过自激活和相互激活的方式进行正反馈调节，同时部分phloem-Dof（如Dof5.3）的转录水平不受CLE信号的调控，这使得在最初开始表达的细胞中phloem-Dof会趋于稳定。此外，研究人员还发现phloem-Dof激活了一种被称为OPS的基因，有报道称OPS会阻碍BAM的功能（Breda et al. 2019，Curr Biol），因此OPS也为phloem-Dof克服CLE的抑制效应提供了拮抗作用。

图3 示意图：DOF-CLE-BAM/CIK信号回路控制韧皮部在恰当的位置形成。

综上所述，该研究阐明了一条植物韧皮部图式发育的DOF-CLE-BAM/CIK负反馈调节回路，即phloem-Dof激活CLE25/26/45小肽，使其分泌到胞外并由BAM/CIK受体系统感知，其信号通路反馈抑制DOF蛋白稳定性，从而侧向抑制周边细胞韧皮部的形成；同时DOF本身转录活性不受CLE抑制，并且其存在自激活和相互激活等正反馈调节，使应该形成韧皮部的细胞克服CLE信号的反馈抑制，最终形成恰当的发育模式（图3）。这一研究从时空维度较为全面地揭示了根尖初生韧皮部发育的分子调控机制，为今后全面解析植物维管束发育奠定了良好的理论基础。

Tatsuo Kakimoto教授研究组的钱平平博士和柴继杰教授研究组的宋文博士为该论文共同第一作者，钱平平博士和Tatsuo Kakimoto教授为共同通讯作者。

这是Tatsuo Kakimoto教授和柴继杰教授两个研究组，继2018年合作揭示“CLE9/10小肽信号通过不同受体系统调控气孔和根木质部发育从而共同作用于植物水分运输和散失”（Qian et al. 2018，Nature Plants）后的又一重要研究发现。上述两项研究（Qian et al. 2018，2022，Nature Plants）也修正了学界普遍认为的，初生和次生生长的木质部和韧皮部都由形成层细胞分裂发育而来的观点。

相关论文信息：

DOI：10.1038/s41477-022-01176-0