制作标准曲线首先需要选择标准品。为了保证标准品和待测样品有一致的扩增效率，标准品与待测样品应有较高的同源性。比如，待测样品是cDNA，可选择cDNA作为标准品。若待测样品是gDNA，可选择gDNA作为标准品。下面分别介绍未知浓度的标准品（以cDNA为例）和已知浓度的标准品（以质粒DNA为例）标准曲线的制作方法。

1.模板稀释

将反转录的cDNA如下图所示进行10倍梯度稀释，6个梯度，依次设置为S1-S6。

2.qPCR反应体系配制：

以Hieff^® SYBR Green为例，配制方式可参照下表，反应体系为20μL。需注意，应根据所使用的定量仪器型号选择相应浓度的校正染料ROX，具体选择方式可参考产品说明书。

【注】*1、NTC阴性对照（No Template Control），是以水为模板的对照，用于确认是否产生引物二聚体和体系中是否有模板污染。

        *2、NRT阴性对照（No reverse transcriptase control），是指在反转录过程中不加入反转录酶得到的样品为模板，用于确认是否含有gDNA污染。

3.样品设置：

qPCR反应体系配制完成后，可参照下表进行样品设置，每个样品均设置3个技术性重复。

4.qPCR反应程序设置

以ABI 7500为例，qPCR反应程序可参照下表进行设置。此外，荧光标记方式应选择SYBR Green，参比染料需选择ROX。

5.标准曲线制作：

qPCR反应结束后，以模板系列稀释倍数log值为X轴，以对应的Ct值为Y轴（反之亦可），制作标准曲线，如下图。 

质粒DNA是含有目的片段的克隆载体。一般是通过PCR扩增目的片段，然后将目的片段插入克隆载体中，提取重组质粒，待测序正确后即可作为标准品。质粒DNA量可用Nanodrop等仪器测定，通过拷贝数换算公式转换成具体的质粒拷贝数，最后进行倍比稀释备用。

拷贝数计算公式：拷贝数=（质量÷相对分子质量）×6.02×10²³。

具体的操作方法与实验设置同未知浓度标准品标准曲线制作方法。

制作完标准曲线后，需要对其进行评估，评估指标有两个，相关系数R²和扩增效率（E）。相关系数R²反应了数据的线性关系，主要用来评估重复样品的可重复性和不同浓度的初始模板是否具有相同的扩增效率。R²值应大于0.98，该值越接近1，表示线性关系越好，数据越准确。

扩增效率（E）计算公式：E=10^-1/斜率-1。

扩增效率（E）：一般认为扩增效率应介于90~110%之间，与之相对应的斜率介于-3.58~-3.1之间。

本期关于引物扩增效率的问题我们就介绍完了，如果您还没有检测过引物的扩增效率，那就赶快按照小编的检测方法操练起来吧。