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中科院分子植物科学卓越创新中心真菌分子遗传与合成生物学研究团队近日在重要药用真菌紫麦角菌中构建了基于核糖核蛋白的高效基因组编辑系统,为麦角生物碱合成途径的解析和重构提供了高效的技术平台。研究成果发表在合成生物学著名学术期刊Synthetic and Systems Biotechnology。
研究背景 麦角生物碱(ergot alkaloids,EAs),简称麦角碱,是一类含氮类吲哚生物碱。它能引起血管平滑肌、瞳孔、尤其是子宫收缩,临床用于产妇分娩后使子宫收缩复原,减少产后出血。EAs主要是以麦角酸为基本结构的一系列衍生物,最早是在麦角菌中发现的。EAs的生物合成基因簇早在20多年前就已经发现,然而由于传统基于同源重组的基因操作效率非常低,导致基因簇中部分基因以及麦角酸下游多种产物的关键合成酶的功能一直无法确定。此前,研究者通过质粒在麦角菌体内表达CRISPR/Cas9进行基因编辑,然而其效率也仅为1-5%。因此,构建高效的遗传编辑平台对于EAs合成途径的解析以及相关细胞工厂的构建极为重要。 作者通过对以往麦角菌遗传操作中存在的问题进行梳理,发现麦角菌遗传操作的主要问题是本身的遗传操作平台不完善。存在可用的抗生素标记不多、适合表达异源蛋白的启动子效率不明确等问题,这些因素导致了体内CRISPR/Cas9编辑方案效率极低。因此,构建基于Cas9和引导RNA(gRNA)预组装核糖核蛋白复合物(RNP)再进行基因编辑方法,可以有效的规避上述问题,提高麦角菌的基因组编辑效率。 研究结果和意义 为了给后续研究提供可循环使用的筛选标记,作者选取了乳清酸磷酸核糖转移酶编码基因ura5为编辑靶标,编辑后可作为内源的筛选标记基因,并利用双向选择的机制构建可回收利用的筛选标记,突破麦角菌中的遗传标记限制问题。通过原生质体转化RNP后,对平板上长出的12个菌落进行测序分析,发现其中6个菌落在靶点发生编辑,编辑效率达50%。作者通过对菌丝形态发育相关基因rac编辑时发现,所有转化子都发生了预期的形态变化,测序结果表明编辑效率达到了100%。这些结果都证明,本研究构建的基于RNP的麦角菌基因编辑技术效率有了大幅度的提升,可以用于麦角碱合成途径的解析。通过对麦角碱合成途径上的关键基因easA作为靶标,获得的转化子均无法在其发酵液中检测到麦角克碱的合成,编辑效率同样达到了100%,说明该方法用于麦角碱生物合成途径的解析和重构是可靠高效的。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金委以及中科院战略生物资源计划等项目的资助。 图: 基于Cas9和引导RNA(gRNA)预组装核糖核蛋白复合物(RNP)的紫麦角菌基因编辑平台示意图。 真菌分子遗传与 合成生物学研究组介绍 课题组的研究方向聚焦于天然化合物合成途径的解析与重构、真菌底盘细胞的分子生物学及应用开发等方面的研究。具体为:(1)天然化合物合成途径关键生物元件的发现、功能鉴定与改造;(2)里氏木霉中纤维素酶合成与分泌调控机制的研究及其遗传改造;(3)重要天然化合物的真菌细胞工厂的设计、构建与适配性优化。近年来,主要在萜类、黄酮类天然化合物的真菌细胞工厂、分泌蛋白的里氏木霉细胞工厂以及在丝状真菌基因组编辑平台取得了系列进展。研究成果发表在Cell Research,Cell Discovery,Science Bulletin,Metabolic Engineering等国内外著名学术期刊。 关于文章 文章标题 Efficient genome editing in Claviceps purpurea using a CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein method 研究团队 Lu Yu,Meili Xiao,Zhihua Zhu,Yinmei Wang,Zhihua Zhou,Pingping Wang,Gen Zou 文章路径 扫码免费阅读 关于期刊 Synthetic and Systems Biotechnology 是高质量国际开放获取期刊,创刊于2016年。期刊覆盖合成生物学、系统生物学以及生物医药等领域的各个方面。 Synthetic and Systems Biotechnology 发表的文章和期刊征稿活动将及时在公众号进行分享,欢迎学者们关注话题集#合成和系统生物技术(SSB),及时掌握期刊研究动态。 期刊现已被SCIE、EMBASE、PubMed Central、Scopus等重要数据库收录。 2021年获得第一个影响因子:4.781,Q1区 2020CiteScore: 8.4,学科领域排名14/113 期刊入选2019年中国科技期刊卓越行动计划高起点新刊项目 期刊是中国生物工程学会合成生物学专业委员会的会刊 期刊是生物反应器工程国家重点实验室的官方期刊 推荐阅读
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GMT+8, 2024-9-5 20:19
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