狂犬病毒糖蛋白抗体的检测与定量:现状与展望（7）

抗原结合检测的设计、优化和验证（ii)

优化工艺后，还必须对方法进行验证和标准化，以获得一致和可互比的结果。分析验证的目的是保证该方法可能产生符合目的的结果。因此，我们必须区分ELISA的目的是定性还是定量。前者的目的是评估检测样品中是否存在分析物(在本例中为狂犬病毒抗体Igs)，以及可检测的最低水平(cut-off，临界值)。相反，在后者的分析中，必须确定低浓度样品定量检测极限(limit of quantitation，LOQ)，并通过与参比标准品（reference standard）进行比较来确定待测样品中被分析物的数量。

如果分别是定性或定量分析，测试的验证程序将是不同的。事实上，验证程序的范围取决于检测的目的，它是由客户需求或法规的要求决定的。对于定性方法，必须通过ROC曲线（感受性曲线）确定敏感性(或其假阴性率)和特异性(或其假阳性率)，在大量的检测样本中找到最佳临界值，避免偏差。在这些类型的测定中，确定临界值最重要。这在一定程度上是因为阈值（临界值）越高，假阳性率越低，从而可保证是发生了真正的血清转化。而对于定量分析，其综合灵敏度、分析灵敏度、线性度、最低浓度样品检测极限（LOD）、低浓度样品定量检测极限（LOQ）、选择性、稳健性（robustness）、准确性、精度(至少重复性和中间精度)必须进行评估。此外，稳定性（stability）也很重要。使用已知稳定性的阿伦斯（arence）标准也是必要的。如果进行了合作研究，则可确定分析的重现性从而使程序标准化。

如前所述，样品特性，如基质（matrix）、稳定性、测定时间、质量、交叉反应抗体，是验证过程中需要考虑的其他重要方面。样品基质会影响或干扰被分析物信号，影响分析的选择性和准确性。因此,除采用相应的空白对照,样品的基质必须通过不同的鉴定和研究，采用的不同统计检验如复苏（recovery)或椭圆联合置信区域( elliptical joint confidence region，EJCR)测试,通过与参考品和将参考品嵌入特定的基质所获得的信号进行比较。

最后，必须证明所建立的 ELISA与金标准方法的相关性。因此，我们想添加一个最后的评论:一些工作表明两种测定方法之间的良好相关性只使用R²系数。然而，皮尔逊(Pearson)系数只测量了一个变量相对于另一个变量的变化，而不是其一致程度。因此，它本身不能提供任何信息，应该补充布兰德和阿特曼图（Bland and Atman diagram ）检验的定量方法，科恩（Cohen）的Kappa或Mc Neman检验的定性方法或其他替代方法，如EJCR（椭圆联合置信区域）检验。

结论与未来展望

狂犬病是世界范围内最致命的传染病之一。每年都有成千上万的死亡报告，但官方数字被认为严重低估了。在这种情况下，PEP（狂犬病暴露后预防）和PREP（狂犬病暴露前预防）是狂犬病控制的主要工具。在此背景下，血清学是狂犬病监测和预防项目的一个关键组成部分，以减轻其对人类、家养和野生动物的风险。

目前，RFFIT和FAVN仍是狂犬病血清学检测VNA（狂犬病毒中和抗体）的金标准。然而，使用伪型重组病毒这样的不同检测方法代表了对传统方法的一个有希望和更安全的替代，其特点是良好的重现性和敏感性。另一方面，ELISA和其他抗原结合试验被认为是抗狂犬病抗体检测的可接受方法，比VNA试验更能保证结果的一致性和耗费更少的时间。然而，没有一种方法绝对就比另一种方法更好，选择将取决于其适合的目的，这意味着应用的血清学试验可以解决特定的问题，获得的数据可以很容易地解释为结果。

设计、优化和验证程序对于达到目的的适宜性和血清学测试的可靠性，从而最终获得可靠的结果是非常关键的。改进狂犬病控制和预防战略的最大挑战之一是标准化和协调全世界的狂犬病血清学结果，这需要国家和国际实验室、公司和监管机构之间的持续合作。

（全文完）

参考文献:

Rodriguez MC, et al., Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol. 2021 Sep;105(18):6547-6557. DOI: 10.1007/s00253-021-11515-4 

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